桦褐孔菌多酚提取条件优化和抗氧化能力研究

潘 林， 李亚楠， 张 志， 朱蕴兰

（1. 齐齐哈尔大学生命与农林学院，抗性基因工程与寒地生物多样性保护重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161005；2. 徐州工程学院食品与生物工程学院，江苏省食品生物加工工程技术研究中心，江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221018）

0 引言

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）是一种具有降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎、降血脂和增强免疫等多种生理活性功能的真菌[1]。桦褐孔菌主要生长在桦树、榆树等树皮或枯干上，其菌核外表为黑灰色或黄褐色至黑色，表面具有不规则裂痕，内部为黄色，无柄，质地坚硬，大小通常在25～40 cm。桦褐孔菌主要分布于俄罗斯、加拿大、日本北海道，以及我国黑龙江省等地。由于桦褐孔菌生长在寒冷地区，生长缓慢，产量较低，是一种稀少真菌。桦褐孔菌有20 多种化学成分具有生物活性，主要是桦褐孔菌多糖、三萜、多酚等，其中多酚是桦褐孔菌抗氧化的主要成分之一。有关桦褐孔菌活性物质提取纯化方法的研究已有很多。朱金卫等[2]对桦褐孔菌液体发酵液中多酚和菌丝体中多酚的制备方法进行了研究。张梅梅等[3]利用正交试验法优化了桦褐孔菌水-乙醇混合体系提取多酚的条件。潘春丽等[4]对桦褐孔菌三萜化合物提取工艺进行了优化。胡涛等[5]利用超声波辅助方法提取桦褐孔菌子实体中多糖和三萜。徐昙烨等[6]利用响应面法优化了桦褐孔菌超声波辅助提取多糖工艺。王畅[7]和王箴言等[8]研究了桦褐孔菌的抗氧化功能。管玉艳等[9]研究了外源因子对桦褐孔菌发酵产桦褐孔醇的影响。但利用超声-微波协同方法提取桦褐孔菌多酚的研究还未见报道，本研究探索用超声-微波协同萃取法提取桦褐孔菌多酚的条件，并测定了多酚的体外抗氧化能力，为进一步研究和开发桦褐孔菌资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）购买于黑龙江大兴安岭森源山产品有限公司。

1.2 药品与试剂

没食子酸标准品、抗坏血酸标准品（山东西亚化学工业有限公司）；乙醇、无水碳酸钠、硫酸亚铁、过氧化氢（天津市福晨化学试剂厂）；福林酚（国药集团化学试剂有限公司）；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，上海源叶生物科技有限公司）。

1.3 仪器

800Y 型高速多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；FA2104N 型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；XO-SM100 型超声波微波协同反应工作站（南京先欧仪器制造公司）；101-1ES 型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 没食子酸标准曲线制作

准确称取0.5 g 没食子酸标准品，稀释到500 mL 容量瓶中，加水定容配制为1 mg/mL 标准液。再从配制好的原液中吸取8 mL，加入到100 mL 容量瓶，加蒸馏水定容，得到0.08 mg/mL 标准液。

准确称取10 g Na2CO3样品，加水进行稀释处理，置于100 mL 容量瓶中，定容至刻度，得到质量浓度10%的Na2CO3。

分别吸取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 和8.00 mL 配制好的0.08 mg/mL 的标准溶液于25 mL 容量瓶中，用去离子水补充至8.00 mL，加入3.00 mL 冰箱保存的福林酚试剂，振荡混匀，在室温条件下暗处反应6～8 min。再在每个容量瓶加入3 mL 配好的Na2CO3溶液，振荡使其混合，暗处理30 min。最后，加水定容至25 mL。在750 nm 波长处，测定样品溶液吸光值。记录不同浓度标准液时的吸光度，以横坐标为样液浓度，纵坐标为吸光值做标准曲线和回归方程。

1.4.2 多酚含量的测定

将桦褐孔菌菌核破碎成小块后于40 °C 鼓风干燥箱中风干，然后用粉碎机粉碎，过40 目筛子备用。

称取一定质量的桦褐孔菌粉末样品，加入设定好的相应浓度的乙醇作为提取溶剂，设定一定料液比、超声波功率参数、微波功率参数，进行提取，时间间隔为10 s，将提取料液进行抽滤得到提取液，每个样品处理3 次，合并提取液备用。

样品测定：取提取液8 mL，然后吸取 1 mol/L Folin-Ciocalteu 溶剂3 mL，滴加至每个待测样中，充分振荡混匀，在室温条件下置暗处反应6～8 min，然后在每个待测液中加入6 mL 配好的Na2CO3溶液，在室温条件下暗处理30 min，加水定容至100 mL，混匀后在750 nm波长处测定吸光值，并记录相关数据。

根据标准曲线的回归方程进行多酚含量的计算，再根据式（1）计算出不同条件下的提取率。

1.4.3 多酚提取条件的单因素试验

分别称取2.0 g 干燥后的样品粉末，测定不同乙醇体积分数（v/v）30%、40%、50%、60 %和70%，不同料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 和1∶80，不同微波功率150、200、250、300、350 和400 W，不同超声波功率70、210、350、560 和700 W，不同提取时间60、120、180、240 和300 s 情况下多酚提取率。在测定时变化一个条件参数，其他参数选定一个值不变。试验基本参数为乙醇体积分数50 %、料液比1∶50（g∶mL）、超声波功率350 W、微波功率350 W、提取时间120 s。

1.4.4 桦褐孔菌多酚提取工艺的正交试验优化

在单因素试验结果基础上，设定乙醇体积分数、料液比、微波功率、超声波功率、运行时间这5 个条件为多因素指标，各个因素指标选取4 个水平，如表1 所示。

表1 因素水平Tab. 1 Factor and level

以相应条件下计算所得出的样品多酚提取率为指标，按L16（45）正交表进行正交试验，优化超声-微波协同提取多酚的工艺参数。

1.4.5 多酚抗氧化活性测定

（1）多酚对DPPH 自由基清除能力的测定。

称取0.039 4 g DPPH 样品，加乙醇定容至1 000 mL，配置0.1 mmol/L 的DPPH 溶液。精确吸取2.0 mL 浓度分别为2、4、6、8、10、12 和14 μg/mL 样品多酚提取液于小试管中，吸取2.0 mL 配制好的0.1 mmol/L 的DPPH 溶液，加入相应的待测组中。摇晃使反应混合均匀，暗处理，在室温条件下反应30 min。空白对照用2.0 mL 蒸馏水加2.0 mL 体积分数为95%的酒精溶液，测定样液在517 nm 波长处的吸光值，根据测定的吸光值以纵坐标为多酚对DPPH 清除率，横坐标为不同浓度参数做图，并求回归方程。按式（2）计算对DPPH 自由基的清除率并计算清除DPPH 的IC50值。

式中R1−DPPH 自由基清除率，%

X−DPPH 溶液加2.0 mL 蒸馏水的吸光度

X1−待测样品加2.0 mL DPPH 的吸光度

X2−样品加2.0 mL 95%乙醇所测的吸光度

（2）多酚对羟基自由基清除能力的测定。

称取质量为0.273 6 g 的硫酸铁，用去离子水进行稀释处理，定容于至100 mL 容量瓶，制成1.8 mmol/L 的硫酸亚铁溶液。

吸取1.00 mL 30 %双氧水溶液，用去离子水进行稀释处理，定容至1 000 mL 容量瓶，制成0.03%双氧水溶液。

准确称取水杨酸样品0.248 6 g，用无水乙醇进行相应稀释处理，定容至100 mL 容量瓶，摇匀得到1.8 mmol/L水杨酸乙醇溶液。

精确吸取1.0 mL 浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8 和l.0 mg/ mL 的多酚提取物于小试管中，分别加入2.0 mL浓度为1.8 mmol/L 的硫酸亚铁溶液，1.5 mL 浓度为1.8 mmol/L 配制好的水杨酸样液，再加入0.1 mL 浓度为0.03%配制好的双氧水溶液，将混合好的试验样品放在水浴锅中，温度参数设定为37 °C，让样品反应30 min。将待测液换成去离子水，作为试验的空白对照，在510 nm 波长处测其吸光值，按式（3）计算清除率并计算清除羟自由基的IC50值。

式中R2−羟基自由基清除率，%

Y−不加相应样品的溶液所测得的吸光值

Y1−加入待测样品反应后的吸光值

Y2−加入蒸馏水的试验组所测出的吸光值

2 结果与分析

2.1 标准曲线

没食子酸标准品与吸光值的线性关系良好，回归方程为y=104.34x-0.024 3，R²=0.997 4，多酚提取率为

式中h−提取率，%（g/g）

y−750 nm 处测得的吸光值

N−稀释倍数

m−桦褐孔菌样品质量，g

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数对桦褐孔菌多酚提取率的影响

乙醇体积分数对超声-微波协同萃取法提取桦褐孔菌多酚提取率影响的试验结果如图1 所示。当提取液乙醇体积分数较低时，桦褐孔菌多酚提取率较低。随着乙醇体积分数的增加，多酚提取率不断增加。当乙醇体积分数为50%时，多酚的提取率最佳。随后乙醇体积分数再增加，多酚的提取率却出现了略微降低。

图1 乙醇体积分数对桦褐孔菌多酚提取率的影响Fig. 1 Effects of ethanol volume fraction on extraction rate of polyphenols from Inonotus obliquus

2.2.2 料液比对桦褐孔菌多酚提取率的影响

不同料液比对超声-微波协同萃取法提取桦褐孔菌多酚提取率影响的试验结果如图2 所示。当料液比增加时，多酚的提取率增加，在物料与溶剂为1∶60（g∶mL）时，多酚提取率达到最高，然后随着料液比增加，多酚提取率降低。

图2 料液比对桦褐孔菌多酚提取率的影响Fig. 2 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of polyphenols from Inonotus obliquus

2.2.3 微波功率对桦褐孔菌多酚提取率的影响

微波功率对超声-微波协同萃取法提取桦褐孔菌多酚提取率影响的试验结果如图3 所示。当微波功率由150 W 逐步增大到350 W 时，多酚的提取率逐渐增加，350 W 时达到最大。

图3 微波功率对桦褐孔菌多酚提取率的影响Fig. 3 Effect of microwave power on extraction rate of polyphenols from Inonotus obliquus

2.2.4 超声波功率对桦褐孔菌多酚提取率的影响

超声波功率对超声-微波协同萃取法提取桦褐孔菌多酚提取率影响的试验结果如图4 所示。使用较低功率的超声波功率进行提取时，多酚提取率较低。随着超声波提取功率的提高，多酚提取率逐渐增加，当超声波功率为350 W 时，多酚的提取率最高。之后，尽管提高超声波功率，但是提取率不但没有升高，反而逐渐下降。

图4 超声波功率对桦褐孔菌多酚提取率的影响Fig. 4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of polyphenols from Inonotus obliquus

2.2.5 提取时间对桦褐孔菌多酚提取率的影响

提取时间对超声-微波协同萃取法提取桦褐孔菌多酚提取率影响的试验结果如图5 所示。当提取时间较短时，多酚提取率较低，逐渐延长提取的时间，可以看出多酚提取率有所增加，当提取时间为120 s 时，多酚的提取率最高。之后，随着提取时间的延长，提取率逐渐下降。

图5 提取时间对桦褐孔菌多酚提取率的影响Fig. 5 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols from Inonotus obliquus

2.3 桦褐孔菌多酚提取条件的正交试验优化

正交试验结果如表2 所示。正交试验最佳工艺条件组合为A1B2C2D2E2，即乙醇体积分数40%、料液比1∶60、微波功率300 W、超声波功率350 W、提取时间180 s，此条件下所得到的多酚提取率为2.486 %。

表2 正交试验结果Tab. 2 Orthogonal test results

运用正交试验中极差法对数据进行分析，由表2 的相关数据可以看出，使用超声-微波协同萃取法，进行桦褐孔菌多酚成分提取的理论最佳工艺参数为A2B2C4D2E3，即乙醇体积分数50%、料液比1∶60、微波功率400 W、超声波功率350 W、提取时间240 s。由于试验最佳组合是A1B2C2D2E2，而理论分析最佳组合是A2B2C4D2E3，因此对理论分析最佳组合进行试验验证，经试验测定得到多酚提取率为2.943 %。

此外，可以得出超声波功率的极差最大，说明超声波功率对试验结果的影响效果最强。各因素对试验结果影响力从大到小排列为D>C>E>B>A。

2.4 多酚抗氧化活性测定结果

2.4.1 多酚对DPPH 自由基的清除能力

桦褐孔菌多酚对DPPH 自由基的清除率如图6 所示，其具有一定的清除DPPH 自由基的能力，并且随着试验样品浓度的增加，DPPH 的清除率也增加。经测定，桦褐孔菌多酚对DPPH 清除率的IC50值为9.03 μg/mL。

图6 桦褐孔菌多酚对DPPH 自由基的清除能力Fig. 6 Scavenging activity of polyphenols from Inonotus obliquus on DPPH free radical

2.4.2 多酚对羟基自由基的清除能力

桦褐孔菌多酚对羟基自由基的清除率如图7 所示，其具有一定的清除羟基自由基的能力，并且羟自由基清除率随着样品浓度的增加而增加。经测定，桦褐孔菌多酚对羟自由基清除率的IC50值为2.03 mg/mL。

图7 桦褐孔菌多酚对羟自由基的清除能力Fig. 7 Scavenging ability of polyphenols from Inonotus obliquus on hydroxyl radical

3 结论

（1）桦褐孔菌多酚的最佳超声−微波协同萃取法提取工艺参数为乙醇体积分数50 %、料液比1∶60、微波功率400 W、超声波功率350 W、提取时间240 s，此时的桦褐孔菌多酚提取率最高为2.943%。

（2）超声−微波协同萃取法获得的桦褐孔菌多酚对DPPH 和羟自由基都有一定的清除能力，但桦褐孔菌多酚对DPPH 自由基的清除能力要好于羟基自由基。

（3）超声−微波协同萃取法可以有效提取桦褐孔菌多酚，且多酚的抗氧化活性未被破坏，超声-微波协同方法是一种实用、有效、快速的提取桦褐孔菌多酚的方法。