电针对小型猪荧光素钠循经迁移的影响研究

王瑾玉，王燕平，熊 枫，王广军，贾术永，宋晓晶，王淑友，谷淑雅，张维波

(1.北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029；2.中国中医科学院针灸研究所,北京 100700)

中医经络的科学内涵是针灸基础研究的重大科学问题。现代经络研究在20世纪中叶正式起步，多学科介入经络研究，发现了一批经络现象[1]。张维波[2-3]在总结这些经络现象及解析中医古典文献经络气血概念的基础上提出了经络的间质通道学说，认为经络是存在于间质中、具有低流阻特性的组织液通道，随后使用生物力学方法证明了经脉线的低流阻特性，又通过一系列实验发现了循经低流阻通道(Low hydraulic resistance channel along meridians，LHRCM)[4]。循经低电阻特性是用低频高压窄脉冲电流在人体上发现的一种低阻经络现象[5]。穆祥等[6]用同样的方法在小型猪上发现了循经低电阻线(Low impedance line along meridian,LILM)。Zhang等[4]发现小型猪的LILM与以往实验中测量到的LHRCM基本重合，二者在体表的平均距离差异为1.4 mm，用LILM可近似确定LHRCM的位置。2018年，美国一团队使用荧光素钠(Sodium fluorescein,SF)在体观察到液态组织液的分布[7]。为使经络可视化，并直接观察到经络中组织液的运动，研究人员建立了荧光照相法，使用SF示踪经络中的组织液,对大鼠的任脉LHRCM进行了活体显示[8]。因为大鼠肢体窄小，很难观测到 SF的循经迁移情况，所以选取了体积稍大四肢短粗的小型猪作为实验动物模型，并对其在肢体上的循经迁移规律进行了观测。结果发现在小型猪四肢12条LILM注射SF后，可以观察到7条以注射点为中心的线状迁移轨迹，这7条迁移轨迹与其对应的7条LILM的总吻合度达81.4%；在LILM旁开的非低电阻区域注射SF后未出现线状迁移，而是以注射点为中心向四周扩散。对SF沿LILM迁移轨迹的横断面进行观察后发现，SF沿皮肤和肌肉的间隙迁移，其横断面呈V字或Y字形，存在于间质中，是一种间质通道[9]。上述一系列实验证明，机体内存在着与中医经络密切相关的循经间质通道。

《灵枢·九针十二原》有“欲以微针通其经脉，调其血气”的描述。本研究基于经络的间质通道学说，使用荧光照相法观察了电针对SF在小型猪前肢外侧中央LILM迁移的影响，并对电针调气的可能机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物 在北京市琉璃河科兴试验动物实验基地，选择4头巴马猪(2头雄性，2头雌性)进行实验。实验用的动物使用许可编号为SCXK (京)2017-0003。每天供应高浓度饲料(希望饲料有限责任公司)，8:00喂料150 g，20:00喂料100 g，不限水，单笼式喂养。在(20±2) ℃的环境下，50%～10%的相对湿度下，在实验室内培养7 d后进行实验。该实验由中国中医科学院伦理委员会批准后进行。

1.2 主要仪器和试剂 R620IE通用型动物麻醉机(深圳瑞沃德)、R409 PLUS大动物呼吸机(深圳瑞沃德)、WQ6F30经络定位仪(北京市海淀区东华电子仪器厂)、LH202H 4导韩氏穴位恒流神经刺激仪(北京华卫产业开发公司)、0.40 mm×25 mm 一次性使用针灸针(北京中研太和医疗器械有限公司)、5D Mark2相机(日本Canon)、MC UV 77 mm窄带滤色镜(日本kenko)、600EX Ⅱ-RT闪光灯(日本Canon)、Filmer 600SLED灯(上海Starison)、滤色纸、T-2000型电子天平[精度0.5 g，美国双杰兄弟(集团)]、异氟烷(进口)、 3%戊巴比妥钠(进口)、盐酸赛拉嗪注射液(兽药字070012926)、20%荧光素钠注射液(国药准字H45011477)。

1.3 实验方法

1.3.1 分组:本研究在四只小型猪的左右共八条前肢上进行实验，采用同体比较，在不同日次分别进行实验。电针组8例，即在每只小型猪的左右前肢各进行1次电针干预，共8次实验；对照组8例，即在每只小型猪的左右前肢同样位置进行不刺激的对照实验，共8次实验。同一只小型猪同一侧前肢的两次实验间隔在3 d以上。

1.3.2 麻醉与备皮:用电推剪除毛发，露出前肢外侧的皮肤，有脏污处用75%的酒精棉球擦拭干净后晾干，随后采用3%的戊巴比妥钠溶液(0.5 ml/kg)和盐酸塞拉嗪注射液(0.1 ml/kg) 分别对小型猪两侧臀部肌肉进行注射麻醉。

1.3.3 循经低电阻线的测定:将经络定位仪参数调整为脉冲60～80 Hz，电流范围50 μA，对低电阻点(Low impedance point,LIP)进行位置测量。测定时，将经络定位仪的基准电极置于小型猪的耳廓背侧面，用一根探头与四肢纵向轴线呈垂直方向，进行均匀扫描，每隔约1 cm进行一次扫描，扫描过程中对微安表进行观察，如若微安计指针陡然转向右侧且超过8 μA，则该点即为LIP，用彩色画笔做记号，往复进行，将所探测到的LIP连接起来即为 LILM。在小型猪前肢的外侧分别探测到3条LILM。本实验选择外侧中央的1条LILM进行电针影响SF迁移的观察。

1.3.4 示踪剂的注射:根据既往研究结果[9]，确定使用20%、0.4 ml、深度3～4 mm的注射参数，体表SF的迁移显示最清晰。在麻醉状态下，电针组与对照组皆统一选取在左右前肢外侧中央的LILM腕部上4.5 cm的一点作为注射点，用1 ml注射器垂直于皮肤表面刺入，深度3～4 mm，然后缓慢推注20%的SF溶液0.4 ml。

1.3.5 成像环境:工作环境温度为(25±1) ℃，相对湿度为30%～60%，室内外通风隔绝。在SF注射和拍摄过程时处于暗室状态，无阳光和灯光照射。

1.3.6 小型猪电针组与对照组的操作:小型猪在麻醉状态下注射SF溶液后，电针组选择原SF注射点作为进针点，将中研太和牌0.40×25 mm针灸针与皮肤呈60°角斜刺入皮肤15 mm，使针体与皮下肌肉组织充分接触。随后接入LH202H韩氏恒流电针仪，一侧电极连接针体，另一侧电极规定在小型猪耳廓外缘。采用100 Hz正负脉冲模式、脉宽0.2 ms、电流在6～9 mA之间适当调节，持续30 min，以肉眼可见肌肉出现持续地节律性收缩为度。对照组仅注射SF溶液，不做任何干预。

1.3.7 荧光照相法:将小猪置于实验台上，采用侧卧位。在Canon5D2数字照相机安装窄带滤色镜，距离小型猪0.5～1 m的范围内，人工调整焦距和曝光。该系统以一台主闪光灯、一台副闪光灯为激发光源，其主、副闪光灯各安装一张蓝滤纸，主副闪光灯之间通过无线传送保证曝光时间的同步。把主闪光灯放置在数码相机侧，位于小型猪腹侧稍高一点，在小猪背侧一边，把副闪光灯放在更低的位置。LED灯配有蓝滤纸，靠近小型猪放置，用以拍摄调焦(图1)。

图1 荧光照相装置示意图

1.4 观察指标 分别在注射后即刻、针刺结束时、针刺结束后30 min对小型猪前肢SF注射部位一带进行荧光照相，观察SF体表迁移的动态轨迹。使用直尺测量SF注射60 min(电针后30 min)后SF体表迁移轨迹沿小型猪前肢纵轴的长度和沿横轴的宽度，然后计算两者的比例，即长宽比。迁移方向以一侧方向的迁移长度比另一侧大1/3以上为有方向性迁移的标准，即以注射点为中心，沿纵轴向上的向心长度比沿纵轴向下的离心长度大1/3以上称为向心迁移，反之称为离心迁移，若向心迁移长度与离心迁移长度的差异小于1/3，则称为双向(等长)迁移。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件。计量资料以均数±标准差表示，并进行正态性分析及方差齐性检验，两者均符合者采用配对样本t检验；若数据仅符合一项或均不符合时，采用Kruskal Wallis H检验；以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 电针组与对照组注射SF后迁移轨迹比较 电针组及对照组在小型猪前肢外侧中部LILM的腕部以上约4.5 cm处注射SF溶液后，均呈现以注射点为中心，沿低电阻线方向出现线状迁移轨迹，其迁移情况见表1(图2)。

注：A、B为对照组注射SF 60 min后的迁移长度和宽度测量，C、D为电针组注射SF 60 min后的迁移长度和宽度测量，绿色×所示为注射点

表1 小型猪电针组与对照组注射SF 60 min后迁移轨迹比较(cm)

与对照组比较，电针组SF迁移轨迹的长度与宽度均明显增加(P<0.01)。测量小型猪前肢的平均长度(从腕横纹到腋横纹)约为(13.50±0.69) cm，电针组平均迁移长度占前肢长度的百分比为33.3%±66.3%，对照组平均迁移长度占前肢长度的百分比为18.6%±36.5%。电针组的长度百分比相对于对照组增加了近1倍。

2.2 电针组与对照组注射SF后迁移方向比较 在小型猪前肢外侧中部LILM的腕部以上约4.5 cm处注射SF溶液后，电针组及对照组SF迁移轨迹的方向情况如表2所示。

表2 电针组与对照组注射SF 60 min后迁移方向比较(cm)

结果显示，注射60 min后，电针组以离心迁移为主，也有双向迁移；对照组以离心迁移为主，除双向迁移外，还有向心迁移。

3 讨 论

SF作为一种易溶于水且无特异性亲和性的“水指示剂”[10]，可与间质中的液态组织液结合，其波长515 nm的黄绿色荧光可被荧光照相法[7-9]有效捕捉到。本研究以SF为示踪剂，通过荧光照相，可显示组织液在体表的分布和运动情况。SF在组织液中的运动包括浓度扩散和组织液对流输运，服从Fick扩散定律,如果存在组织液的向经脉流动和循经流动[4]，则SF在纵向(向心或离心)和横向的迁移长度会显著不同，并出现向心和离心两个方向上迁移长度的不对称。

研究发现，电针组和对照组均出现了SF沿LILM的体表迁移轨迹，但也有垂直于LILM沿肢体横轴方向的迁移，两组迁移的距离在纵向与横向上皆明显不对称，表现为纵向循经的方向上有明显优势的迁移，长宽比接近2.5，具有一定的线状迁移特征，说明经脉通道存在一定的横向约束性，此结果与本团队之前的研究结果一致[9]。进一步比较发现，相较于对照组，电针组的迁移轨迹在长度和宽度方面均有显著增加，说明电针可以促进组织液的流动，使SF的迁移距离更长。

研究中观察到电针组和对照组的SF迁移轨迹方向以离心迁移为主，也有双向迁移，对照组还出现向心迁移。这种不同方向的迁移可能与经气的运行方向有关。经脉是运行气血的通道，《内经》中经脉的循行方向有不同的模式，主要的三种模式是上下交替的循环流注，自下而上循行和自上而下循行[11]。《灵枢·营气》记述的“气从太阴出注手阳明，上行注足阳明，下行至跗上，注大指间，与太阴合，下行至跗上，注大指间，与太阴合……合足厥阴，上行至肝，从肝上注肺”就属于上下交替的循环流注，《灵枢·逆顺肥瘦》对这种循行模式总结为“手之三阴，从脏走手，手之三阳，从手走头，足之三阳，从头走足，足之三阴，从足走腹” 。《灵枢·卫气》中经气的运行为自下而上(向心)，而《灵枢·卫气行》所载卫气的循行都是从头面行于手足的离心方面。本研究观察到组织液迁移的不同方向，支持了《内经》中经气运行不同方向的记载。

现代研究发现影响组织液流动的因素有血管脉动、运动与肢体的主动和被动收缩等[12-14]。本研究通过电针引发的肌肉节律性收缩与肢体的主动被动收缩类似。电针可以提高肌肉组织的兴奋性，引起肌肉收缩[15]，肌肉的节律性收缩可挤压组织间隙并形成波动变化的组织液压，根据组织液流动的达西定律，此波动压力可推动组织液流动，形成更长更宽的SF轨迹，类似心脏节律性收缩推动血液流动的过程。《灵枢·经脉》云：“经脉者，伏行分肉之间”， 狭义的分肉可理解为“肉分之间，谿谷之会，以行荣卫，以会大气”(《素问·气穴论》)的肌肉间隙，其两侧的肌肉形成了经脉通道的外壁，经络通道周围的肌肉状态可能影响通道的通畅性,进而影响“气-组织液”的运行[2]。贾术永等[16]在此基础上使用恒流电针仪刺激小型猪四肢循经低流阻通道上的低流阻点附近的肌肉,发现当电流达到7 mA以上时,肌肉可出现强直收缩，同时流阻也显著增加，说明肌肉状态可影响肌肉间隙的大小和阻力，进而影响组织液的流动。为防止小型猪四肢肌肉对电刺激耐受，本实验控制恒流电流在6～9 mA之间适当调节,以从皮肤表面可观察到肌肉节律性收缩为度，并保持肌肉一直处于节律性收缩而非强直或不收缩的两种状态，通过肌肉节律性收缩，组织液的运行动力得以加强。古人描述针刺“得气”时施术者手下会有“如鱼吞饵之势”，即手下沉紧感。肌肉内的牵拉感受器-肌梭被认为是针刺得气的解剖基础之一，而肌梭激发的标志正是施术者有针下沉紧感或“吸针感”。当混有运动神经的纤维穿入肌肉或称为“运动点”被刺中时，可以发生肉眼可见的整条肌纤维的抽搐[17]，这与本实验通过控制电针参数从而观察到的实验现象相似。陆凤燕等[18]发现，针刺穴区不同组织结构出现得气针感过程中的积分肌电值(iEMG)显著高于针刺前，证明针刺效应与肌肉的活动高度相关。此外，邓丽芬等[19]使用电针观察受试者足三里，得气后可得到较强的电针肌缩反应，也说明电针引起肌肉反应的强弱可以作为判断是否得气或得气程度的客观参考指征之一。

肌肉属中医经筋的范畴。近年来针对经筋本质的探析可分为神经学说、肌肉学说、神经肌肉学说、肌筋膜以及一套相对完整的循行系统，其中尤以筋肉学说、神经肌肉学说最为盛行[20-21]。薛立功等[22]认为，“经筋”是一种以经脉为总纲，由骨骼肌、韧带等组成的系统，也是一种对机体筋肉及其周围组织生理表现和病理症候的高度概述。“壮者之气血盛，其肌肉滑，气道通，营卫之行不失其常，故昼精而夜瞑。老者之气血衰，其肌肉枯，气道涩，五脏之气相搏，其营气衰少而卫气内伐，故昼不精，夜不瞑”(《灵枢·营卫生会》)。说明经脉是“着藏”在“经筋”之中的，经筋经脉相伴而行，相须为用，经脉中的津液气血可濡养经筋，使其束骨、利关节的功能正常，为经脉通道中气血的运行提供了动力。而当经筋病变，失其正常舒缩功能，则经脉通道就变得滞涩，影响气血的正常运行。本实验用电针刺激属于经筋的循经肌肉，引起其节律性收缩，促进了经脉中的组织液流动，加强经脉“行血气，营阴阳”的功能，佐证了经脉与经筋的密切关系。李端午等[23]通过针刺受试者一侧太冲穴，观察到针刺可促进经脉内的核素运行，与用荧光素钠示踪的动物实验结果相吻合。

本研究是在麻醉状态下的小型猪上进行的，与清醒状态下人的针刺情况仍有一定差异。进一步的研究可找寻一种在小型猪清醒状态下进行针刺施术操作和示踪观察的实验方法，使动物的状态与人类针灸时更接近。当然，最终证明针刺对经气的调节作用还需直接在人体上进行试验，也可考虑从组织形态学角度对电针影响组织液流动的范围进行更准确的测定，是针刺研究未来的方向。

本研究首次使用可视化方法研究针刺的效应，发现电针引起肌肉兴奋可增强荧光素钠线状迁移，为经脉的间质通道学说和低流阻通道中的组织液与经气密切相关的观点[24]提供了进一步的影像学证据，也为针灸可通过经筋调节经脉气血的途径提供了科学依据。