人原发性肺癌组织中Rab相互作用溶酶体蛋白基因甲基化检测及其临床意义

余纪会,高 税,王晓琼 (.重庆医科大学附属第一医院健康管理中心，重庆 40006;.重庆医科大学附属长寿人民医院呼吸与危重症医学科，重庆 4000)

原发性支气管肺癌简称肺癌，基于不同的组织病理学分型，肺癌主要分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC包括腺癌和鳞状细胞癌两种亚型[1-2]。目前，肺癌仍然是威胁人类生命和健康的恶性肿瘤之一，并且发病率呈现出上升之势[3-5]。肺癌的早期诊断率不到20%，75%的肺癌患者确诊时已处于中晚期[6]。早期肺癌的治疗通常选择手术切除，晚期肺癌发生转移时主要采用化疗、靶向治疗和化疗联合免疫治疗[7-8]。尽管近年来肺癌的研究取得了很大的进展，但是患者的5年生存率仍未见明显提高[9-11]，因此，有必要对肺癌的机制进行深入探讨。

Rab相互作用溶酶体蛋白(Rab interacting lysosomal protein，RILP)是内吞途径的关键调节蛋白，在内体—溶酶体运输的调节中起着关键作用[12-13]。既往研究显示，RILP可通过影响癌细胞的侵袭和迁移促进癌症进展，包括乳腺癌[14]、肝细胞癌[15]、宫颈癌[16]。然而RILP与NSCLC的关系既往少有报道。基因异常表达对癌症病因学至关重要，遗传和表观遗传变化的联合作用促进了人类癌症的发展[17]。基因甲基化作为表观遗传修饰的关键元素，在调节细胞功能和致癌过程中起着重要作用[18-19]。有研究发现，RILP甲基化可能影响肺癌细胞的侵袭和迁移[20]，但其具体机制尚未明确。本研究通过分析肺癌患者中RILP的表达水平和甲基化状态，旨在探讨其与肺癌发生发展的关系，以及其作为肺癌早期诊断指标的可能性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

纳入2018年3月至2020年3月重庆医科大学附属长寿人民医院收治的88例原发性肺癌患者，均经组织病理学检查确诊。其中男50例，女38例；年龄(65.09±6.24)岁；鳞状细胞癌48例，腺癌40例；低分化38例，中分化38例，高分化12例；肿瘤分期Ⅰ期36例，Ⅱ期25例，Ⅲ期25例，Ⅳ期2例。术中留取肺癌组织及相应的癌旁组织(距离肺癌组织≥5 cm)。本研究经重庆医科大学附属长寿人民医院伦理委员会批准(2018003)，患者均签署知情同意书。

1.2 肺癌细胞系及培养

选取5种肺癌细胞系(H1299、A549、H358、H1993和H460)和正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)，在含10%胎牛血清的RPMI 1640(Gibico，美国)中培养。细胞在T75规格培养瓶中达到80%融合后以1∶3传代培养，培养至3～5代的细胞用于后续实验。将10 μmol/L 5-氮杂-2脱氧胞苷添加到细胞培养基中，参照细胞去甲基化处理试剂盒(Sigma公司，美国)对细胞进行去甲基化处理。

1.3 免疫组化染色检测RILP表达

肺癌组织及癌旁组织标本以福尔马林固定，石蜡包埋，采用切片机将包埋的组织蜡块连续切成 4 μm厚的切片。石蜡切片采用二甲苯脱蜡，分级乙醇脱水，然后用3%过氧化氢使其内源性过氧化物酶活性猝灭30 min，采用10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复2 min，随后以磷酸盐缓冲液冲洗切片，再用山羊血清封闭15 min，将载玻片与兔抗RILP一抗(Proteintech，美国)以1∶200的稀释度在4 ℃下孵育过夜，磷酸盐缓冲液清洗后，在室温下使用生物素化辣根过氧化物酶羊抗鼠/兔二抗孵育20 min。切片用3,3’-二氨基联苯胺四氢氯化物孵育5 min，随后在自来水下清洗并用苏木精复染。最后，通过显微镜观察切片组织中的RILP蛋白表达。每张切片随机取10个视野，每个视野计数100个癌细胞，根据细胞的染色强度及阳性细胞比例判断RILP表达情况。染色为阴性记0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分；阳性细胞数为0～10%记1分，11%～50%记2分，51%～80%记3分，81%～100%记4分，将二者评分相乘得出最终结果：0分为阴性，1～3分为弱阳性，4～8分为中等阳性，9～12分为强阳性。其中0～3分为低表达，4～12分为高表达。

1.4 荧光定量PCR检测RILP mRNA表达

根据产品说明书，使用TRIZOL试剂(Invitrogen，美国)从肺癌组织及癌旁组织中提取总RNA；从肺癌细胞系(H1299、A549、H358、H1993和H460)和正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)中提取细胞总RNA。采用iScript-cDNA合成试剂盒(Bio-Rad公司，美国)合成单链cDNA。用SYBR-Green PCR试剂盒(Bio-Rad公司，美国)进行实时荧光定量PCR扩增反应，并使用CFX96实时PCR系统(Bio-Rad公司，美国)进行检测，扩增引物序列见表1。PCR反应条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 35 s，39个循环。40 ℃延伸时采集荧光信号，PCR产物经熔融曲线分析验证。使用2-ΔΔct法，通过管家基因β-actin值计算靶基因的相对表达水平。

表1 扩增引物序列表

1.5 甲基化特异性PCR检测RILP基因的甲基化

为了验证RILP基因水平是否受DNA甲基化调控，通过甲基化特异性PCR对肺癌细胞系(H1299、A549、H358、H1993和H460)、肺癌组织以及癌旁组织进行甲基化检测。采用DNA提取试剂盒(全式金生物技术有限公司，北京)提取肺癌组织、癌旁组织和肺癌细胞系DNA，并以琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行验证。利用EpiMethy DNA甲基化检测试剂盒(锐赛生物医药科技有限公司，上海)对产物修饰处理后进行PCR扩增，扩增引物序列见表2。分析肺癌患者临床资料与RILP甲基化的关系。

表2 扩增引物序列表

1.6 克隆形成实验检测细胞增殖活性

转染前，A549细胞在6孔板中培养24 h。根据转染试剂盒(赛默飞，美国)说明书，用空载体或人源RILP表达载体(淼灵生物科技有限公司，武汉)转染A549细胞。取转染后对数期细胞，以每孔800个细胞接种到6孔板中，以含500 μg/mL G418的生长培养基培养细胞，每24 h换液。14 d后用75%乙醇固定细胞30 min，并用0.2%结晶紫染色进行观察和计数。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 RILP在肺癌组织及肺癌细胞系中的表达

免疫组化染色结果显示，肺癌组织RILP高表达率为13.64%(12/88)，癌旁组织RILP高表达率为76.14%(67/88)，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

图1 RILP的免疫组化染色图

荧光定量PCR检测结果显示，癌旁组织RILP mRNA表达水平高于肺癌组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2a。正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)中RILP mRNA表达水平高于肺癌细胞系(H1299、A549、H358、H1993和H460)，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2b。

a:癌旁组织和肺癌组织的RILP mRNA相对表达水平比较；b:正常肺上皮细胞系和肺癌细胞系RILP mRNA相对表达水平比较 *：与癌旁组织比较，P<0.05；**：与BEAS-2B比较，P<0.01；***：与BEAS-2B比较，P<0.001

2.2 RILP基因甲基化检测

与正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)相比，RILP基因在肺癌细胞系(H1299、A549、H358、H1993和H460)中出现了明显的甲基化，见图3a；在肺癌组织中也出现了不同程度的RILP基因甲基化，而癌旁组织未发生RILP基因甲基化，肺癌组织与癌旁组织比较，出现较为明显的基化条带，见图3b。为进一步探讨甲基化对RILP基因表达的调控，用甲基化转移酶抑制剂处理肺癌细胞系(H1299、A549、H358、H1993和H460)，结果显示去甲基化处理后RILP基因表达水平升高(图3c)，说明RILP受甲基化调控。

a:正常肺上皮细胞系和肺癌细胞系中RILP基因甲基化检测结果；b:肺癌组织及癌旁组织中RILP基因甲基化检测结果；c:去甲基化处理后肺癌细胞系中RILP基因的表达 U：非甲基化特异性引物；M：甲基化特异性引物；-：未甲基化转移酶抑制剂处理；+：甲基化转移酶抑制剂处理

2.3 RILP基因甲基化与肺癌患者临床特征的相关性

60.23%(53/88)的肺癌患者发生RILP基因甲基化，39.77%(35/88)未发生甲基化。RILP甲基化与RILP非甲基化患者肿瘤分化程度比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。提示RILP基因甲基化与肺癌恶性程度相关。

表3 肺癌患者一般临床资料与RILP甲基化的关系(例)

2.4 克隆形成实验评估RILP对肺癌细胞的影响

A549细胞过表达RILP基因后，其增殖能力明显受到抑制(P<0.05)，见图4。提示RILP有明显的抑癌作用。

a:各组细胞菌落图片;b:各组克隆细胞数比较 ***:与空载体比较，P<0.001

3 讨论

临床上，只有不到20%的肺癌患者获得早期诊断[5]。尽管引入了低剂量计算机断层扫描并实施了肺癌筛查计划，但就发病率和病死率而言，肺癌仍然是全世界癌症患者特异性死亡的主要原因[3]。肿瘤的发生发展存在广泛的遗传变化和相关的基因功能及活动失调，其中DNA甲基化是表征最好的表观遗传修饰元素之一，DNA甲基化可影响基因表达和基因组稳定性，对肿瘤的发生发展具有重要影响[18]。越来越多的研究显示，组织、血液，甚至气道脱落上皮细胞的甲基化状态有望成为诊断肺癌的生物学标志物[21-22]。

RILP作为囊泡运输的分子开关，在囊泡形成、转运、黏附和融合过程中起着重要作用[12]。RILP通过其羧基末端区域与活化的三磷酸鸟苷结合，进一步与动力蛋白—动力蛋白运动复合体的黏合亚单位相互作用，以调控细胞质中的晚期内体或溶酶体的分布[12-13]。细胞迁移是一个对细胞极为重要的过程，由几个整合高度调节的事件组成，如细胞骨架重排、不对称极化、细胞黏附和扩散[23]。有研究表明，膜转运的改变可以影响细胞的生长和迁移，是人类癌症发展的重要原因之一[24]。另有研究显示，RILP在乳腺癌中能起到肿瘤抑制作用，RILP的缺失会促进乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭[14]。还有研究显示，沉默RILP也能加速肺癌细胞H1299迁移，提示RILP可能作为肿瘤抑制因子发挥作用[25]。本研究结果显示，RILP在肺癌组织和肺癌细胞系中的表达均显著下调，提示RILP可能作为肿瘤抑制因子参与肺癌的发生发展。

肿瘤抑制基因启动子CpG岛中的异常DNA甲基化被认为是基因下调的主要机制，这会促使正常细胞发生癌变[26]。本研究发现，肺癌组织中RILP基因出现高甲基化，并且与肿瘤分化程度有关，提示RILP基因甲基化程度与肺癌恶性程度相关。本研究通过对肺癌细胞系甲基化转移酶抑制剂处理后，RILP基因在5种肺癌细胞系中表达增加，说明RILP受甲基化调控。以上结果提示，基因甲基化机制可能是肺癌细胞中RILP表达调控的主要分子机制。本研究中克隆形成实验结果显示，RILP可抑制肺癌细胞增殖，表明RILP在肺癌发生中具有抑制作用。提示RILP有望成为诊断肺癌的生物学标志物。

综上所述，RILP可能作为抑癌基因在肺癌中发挥作用，并且受甲基化调控。本研究初步证明了RILP是肺癌潜在的生物学标志物，对肺癌早期诊断存在提示作用。然而本研究也存在一些局限性，如未分析RILP下游信号通路的变化，未对肺癌患者进行随访，没有分析RILP及其甲基化与患者生存预后的关系。未来需要开展细胞及动物实验，深入分析RILP的作用机制。