转录因子BACH1的研究进展＊

何韫荃，郭阶雨，魏香香，孟丹

复旦大学 基础医学院生理与病理生理学系，上海 200032

1 BACH1的调控机制

转录因子BTB-CNC同源体1(BTB and CNC homology 1, BACH1)属于碱性亮氨酸拉链蛋白家族，作为一个转录因子广泛存在于哺乳动物组织中。BACH1的N端包含一个BTB/POZ结构域，是蛋白质相互作用基序(motif)；C端bZip结构域与DNA结合，介导BACH1与小Maf蛋白(small musculoaponeurotic fibrosarcoma proteins)结合形成异二聚体。BACH1在氧化应激调节中起到重要作用。在正常情况下，BACH1在细胞核内与Maf识别元件(Maf recognition elements, MAREs)结合，抑制血红素环氧化酶-1(heme oxygenase 1, HO-1)等氧化应激反应基因的转录。在氧化应激压力下，血红蛋白释放游离血红素，与BACH1的结合使其出核，从而发生泛素化降解。同时，氧化应激积累的核因子相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2, NRF2)与小Maf蛋白结合，上调包括HO-1在内的一系列抗氧化基因的表达，保护细胞抵抗氧化应激。

以往的研究侧重于阐明BACH1对其下游靶基因及细胞信号转导的调控作用，而关于BACH1自身和上游如何被调控的机制研究较少。早期有研究认为SP1结合在BACH1基因的启动子区，调控BACH1的基础表达水平[1]。还有研究发现BACH1有自调控作用：BACH1通过与启动子区结合来抑制自身转录，说明BACH1可以是自身的直接转录抑制因子，BACH1存在自身负反馈调节机制[2]。最近的一些研究认为MAPK家族对BACH1的调控有重要作用，通过激活p38/MAPK，同时抑制ERK1/2通路，可以诱导BACH1入核，下调HO-1的表达[3-5]。血红素和镉是HO-1的有效诱导剂：血红素能够抑制BACH1的DNA结合活性，使HO-1去抑制[4]；镉通过依次激活p38激酶途径和NRF2诱导HO-1表达，以一种非血红素依赖的机制抑制BACH1的活性[5]。其他与BACH1活性相关的因素包括低氧诱导、氧化应激产生的炎症因子等，其机制有待进一步研究。

2 BACH1与心血管疾病

血管新生是血管发育中的关键过程，与缺血性心血管疾病以及肿瘤发展等多种病理生理过程息息相关。已有研究证明BACH1通过转录调控血管生成素1(angiopoietin-1, Ang-1)等血管生成因子，以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α (peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α, PGC-1α)、成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)等[6-7]调节氧化应激[8]，影响促血管生成活性，在血管新生中发挥重要作用。我们课题组以往的研究表明，BACH1是成年小鼠缺血后血管新生的负调控因子。WNT信号通路是促进血管新生的经典通路，β联蛋白(β-catenin)入核与转录因子4(transcription factor 4, TCF4)形成复合物，激活基因表达。而BACH1竞争性地抑制β联蛋白/TCF4结合，并招募组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1, HDAC1)结合到TCF4靶基因的启动子上，抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)等促血管生成因子的表达[9-10](图1(a))。进一步研究证实，BACH1可以直接与TCF4结合，这种相互作用由BACH1的N端BTB结构域残基81～89和TCF4的N端结构域介导。缺失BTB结构域的BACH1不能结合并激活HDAC1。这些结果表明BACH1的抗血管新生作用很大程度上依赖于其BTB结构域介导的分子相互作用，该结构域有望成为血管生成治疗的药物靶点[11]。我们最近筛选的抑制BACH1的小分子化合物具有明显的促进成年小鼠缺血下肢血管新生的作用(未发表工作)，提示BACH1将来可作为缺血性疾病促血管新生治疗的靶点。

图1 BACH1的转录激活及抑制作用

最近，全基因组关联研究(genome-wide association studies, GWAS)提示BACH1可能是人冠状动脉性心脏病(coronary artery disease, CAD)潜在的候选基因[12]。BACH1协助MAF碱性亮氨酸拉链转录因子F(MAF basic leucine zipper transcription factor F, MAFF)在脂多糖刺激下抑制肝细胞中低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein receptor, LDLR)的表达[13]，提示BACH1可能与炎症以及脂质代谢相关。BACH1是心肌缺血后的早期诱导基因[11]。以往研究表明BACH1通过抑制HO-1加速心血管疾病的进程：在老年高血压小鼠模型中，BACH1表达升高，伴随着HO-1水平显著降低[14]；全身敲除Bach1可以上调HO-1的水平，缓解小鼠心肌受到的缺血再灌注损伤，减少心肌梗死面积[15-16]。Bach1敲除抑制主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction,TAC)模型诱导的小鼠左室肥厚，抑制HO-1将阻断这一保护作用[17]。然而，有研究发现，在Bach1敲除小鼠中，其巨噬细胞吞噬活性、平滑肌增殖以及股动脉内膜新生均受到抑制，提示BACH1对炎症和动脉粥样硬化的调节作用，而且这种抑制不受HO-1抑制剂的影响[18]。以上结果说明，BACH1调节平滑肌细胞增殖和血管内膜形成的机制中存在非HO-1依赖途径，BACH1对心血管疾病的作用机制还有待进一步阐明。以往的研究主要利用Bach1全身敲除的小鼠为动物模型，很难明确BACH1对心血管细胞的作用是否是特异性的，因此，利用心血管细胞特异性Bach1基因敲除小鼠模型来阐明BACH1对心血管疾病的调控作用具有重要意义。

3 BACH1与干细胞

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，能够增殖分化为各种组织细胞，是再生医学的重要内容，有着良好的临床应用前景。干细胞如何维持其多能性以及如何促进它定向分化一直是科学研究的热点。BACH1在小鼠胚胎中高表达[19]，通过抑制Pparg等基因可抑制小鼠胚胎成纤维细胞向脂肪细胞分化[20]。在红细胞分化过程中，BACH1与MafK在β-珠蛋白基因座控制区(locus control region, LCR)结合形成二聚体时，会招募SIN3A、SWI/SNF等一系列具有染色质重塑和去乙酰化酶活性的转录共抑制复合物，使β-珠蛋白基因表达降低，红细胞分化随之转变为抑制模式[21](图1(b))。这些都提示着BACH1参与干细胞的命运调控。

干细胞的多能性和自我更新与泛素连接酶和去泛素化酶的活性调节有关[22]。我们课题组最近的研究发现BACH1是调控人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)命运决定和干细胞向中内胚层分化的重要因子[23]。在hESCs中，BACH1招募一种去泛素化酶——泛素特异性加工蛋白酶7(ubiquitin-specific processing protease 7, USP7)，提高干细胞多能性基因NANOG、SOX2、OCT4的稳定性，以维持hESCs的干性和自我更新能力。同时，干细胞发育的早期阶段受到多种信号分子的调控，我们发现在hESCs中敲除BACH1可激活WNT/β联蛋白以及Nodal/SMAD 2/3信号通路，促进干细胞向中内胚层分化。另外，组蛋白修饰和染色质重塑对干细胞的发育和分化也有重要作用[24]。BACH1通过招募多梳蛋白抑制性复合体2(poly-comb repressive complex 2, PRC2)，与它的亚基EZH2直接作用，促进组蛋白3的27位赖氨酸三甲基化(trimethylation of histone H3 on lysine 27, H3K27me3)，沉默T、GATA6、MSX2等下游中内胚层基因，维持干细胞自我更新能力并抑制其早期分化(图1(c))。有大量研究表明超级增强子与细胞的命运决定密切相关[25-27]。我们发现在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)中，BACH1作为染色质环的关键蛋白，不仅招募NANOG和组蛋白赖氨酸甲基化酶MLL/SET1复合物到染色质上，而且调节远端NANOG在染色质上的结合，维持多能性基因上H3K4me3高水平，增强其启动子-增强子活性和下游基因表达，维持mESCs的多能性[28](图1(d))。缺乏BTB或者bZIP结构域的BACH1无法与MLL/SET1复合物结合，表明BACH1的BTB结构域和bZIP结构域对其维持mESCs多能性的作用是必不可少的。此外，代谢类型的转换也是决定干细胞状态的一个重要因素，激活干细胞分化往往伴随细胞代谢从无氧糖酵解到线粒体氧化磷酸化的改变[29-30]，在骨髓前体细胞中抑制丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)活性，将会抑制线粒体氧化磷酸化，维持前体细胞的静息状态[31]。BACH1调控糖酵解和氧化磷酸化的相关基因[32-33]，可能介导干细胞代谢转换，影响干细胞静息和分化状态，但目前未见相关报道。以上研究结果表明，BACH1是干细胞维持自我更新和早期分化过程中的关键转录调控因子。这为了解干细胞的命运决定机制提供了重要的线索。

结合之前的研究，我们发现BACH1既可以作为转录抑制因子，也可以作为激活因子发挥作用。BACH1通过招募MLL/SET1复合物来调节H3K4的甲基化状态，促进启动子-增强子区H3K4me1向H3K4me3转变，激活干细胞多能性基因的表达；同时又作为转录抑制因子阻碍细胞分化以及血管新生。BACH1诱导的转录激活或抑制作用可能与其招募不同的因子，以及细胞类型、细胞状态和局部微环境有关[34]。BACH1是重要的表观遗传调节因子，它招募不同的表观遗传修饰因子，如HDAC1、SIN3A、PRC2以及MLL/SET1复合物等，通过不同的组蛋白修饰对下游基因实现转录激活或沉默作用(图1)。目前尚不清楚的是在心血管疾病及肿瘤疾病中，BACH1不同的转录调控选择在其疾病病理生理发展过程中扮演着什么样的角色，这需要进一步研究。

4 BACH1与肿瘤

4.1 BACH1参与肿瘤转移

已有大量研究证实BACH1是一个促肿瘤转移因子。转移性肺癌组织中存在高表达的BACH1，外源抗氧化剂[32]以及Keap1基因[33]缺失均通过减少细胞内游离血红素，增加BACH1蛋白水平，促进肺癌细胞的转移过程。高表达的BACH1提高了乳腺癌[35-37]、胰腺导管腺癌[38]、食管癌[39]、结直肠癌[40-42]、前列腺癌[43]以及卵巢癌[44]细胞的迁移活性，是这些癌症预后较差的一个重要因素。BACH1通过多种途径推动肿瘤细胞的迁移和侵袭。BACH1可以上调转移相关如CXC-趋化因子受体4(CXC-chemokine receptor 4,CXCR4)、波形蛋白(vimentin)以及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等的表达，促进肿瘤的转移[37,40,43](图2(a))。肿瘤抑制基因和DNA修复基因的启动子相关CpG岛的位点特异性DNA高甲基化称为CIMP表型，临床上有证据表明CIMP与肿瘤预后高度相关[45]。BACH1与MAFG结合在DNA错配修复基因MLH1启动子区，并招募辅抑制因子CHD8以及DNA甲基转移酶DNMT3B，使MLH1及其他CIMP基因获得高甲基化修饰，导致转录失活，从而促进肿瘤的启动和发展[42](图2(b))。目前关于BACH1参与肿瘤转移的研究主要集中在BACH1调节肿瘤代谢以及促进上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)两个方面。

图2 BACH1参与肿瘤转移

4.1.1 BACH1调节肿瘤代谢

在肿瘤微环境中，肿瘤细胞表现出不同的代谢表型以支持其生存和增殖状态[46]。BACH1参与肿瘤细胞的代谢重编程[35-36]。肿瘤细胞最常见的代谢表型变化是有氧糖酵解的增加和乳酸的产生[47-48]。BACH1通过激活己糖激酶2(hexokinase 2, HK2)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)，促进葡萄糖摄取和乳酸分泌，增加糖酵解速率，推动肺癌的发生发展。阻断参与糖酵解途径的BACH1靶基因可以显著减少肺癌细胞的转移表型[32](图2(c))。肿瘤细胞活跃的线粒体代谢也是治疗的热门靶点。在三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)细胞中，BACH1通过负向调控线粒体电子传递链(electron transport chain, ETC)基因的表达，抑制线粒体代谢。此外，BACH1还会抑制丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)的活性，降低三羧酸循环中间产物水平[33]。敲低BACH1可以抑制TNBC细胞的肺转移，并使其对二甲双胍敏感，提示靶向抑制BACH1可以通过增加线粒体代谢来重新编程肿瘤代谢，从而使肿瘤细胞易受线粒体呼吸抑制剂的影响[36](图2(d))。

4.1.2 BACH1促进上皮-间充质转化

上皮-间充质转化是黏附性上皮细胞转化为可活动的间充质细胞的过程，与上皮来源的恶性肿瘤侵袭和转移高度相关，是转移性肿瘤预后较差的原因之一。有研究证明在肿瘤转移模型中，BACH1与肿瘤细胞发生EMT密切相关[38-39,44]。在胰腺导管腺癌细胞中，BACH1直接抑制FOXA1以及CLDN3和CLDN4等一系列上皮黏附基因的表达，破坏上皮表型的维持，推进EMT发展，参与了胰腺癌的恶性发展[38](图2e)。我们的研究发现，BACH1在人卵巢上皮癌组织中的表达显著增高，通过招募高迁移率族蛋白A2(highmobility group AT-hook protein 2, HMGA2)结合在包括SLUG和SNAIL在内的EMT相关基因的启动子区，增加其表达，促进卵巢癌迁移。BACH1诱导EMT的作用依赖于HMGA2(图2(e))。此外，BACH1激活p-AKT和p-p70S6K，增加细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)的表达，促进卵巢癌细胞的生长和移植瘤的生长[44]。根据以上BACH1对肿瘤代谢和EMT调控作用的研究报道，可以认为BACH1是针对肿瘤细胞增殖迁移的重要治疗靶点。

4.2 BACH1与肿瘤细胞铁死亡

铁死亡是一种铁催化的非凋亡细胞死亡形式，由脂质过氧化介导发生[49]。与普通的非肿瘤细胞相比，肿瘤细胞对铁的需求更高，这种对铁的依赖使得肿瘤细胞更容易发生铁死亡。通过诱导铁死亡可以在实验肿瘤模型中发挥抗肿瘤效果。铁池通常以Fe2+形式存在，称为不稳定铁池(labile iron pool, LIP)。在铁死亡的调节中，非经典的铁死亡诱导通过过度激活HO-1[50]，给细胞过量加载铁，增加LIP启动铁死亡[51]。另外，抑制NRF2可以增强细胞对铁死亡的敏感性[52]。鉴于BACH1参与血红素和铁相关的氧化应激反应和代谢途径[53]，提示BACH1-NRF2-HO-1调控环可能通过氧化应激的作用，对肿瘤细胞的铁死亡产生影响。已有研究报道，在小分子爱拉斯汀(erastin)诱导的铁死亡过程中，一系列参与谷胱甘肽和活性铁代谢的保护性基因表达会随之升高。BACH1通过抑制这些基因的转录来促进铁死亡，加重缺血性心脏病、心梗等疾病[54]，但BACH1促进肿瘤细胞铁死亡也许是一种保护作用，具体机制有待阐明。

这提示我们BACH1在肿瘤中可能有双重功能。有报道认为BACH1是一种肿瘤抑制因子，人类BACH1基因3'端非翻译区单核苷酸突变(rs372883T＞C)将会使BACH1表达升高，可以降低胰腺癌发病风险[55]，提示BACH1可能在癌症形成的某些阶段发挥抑癌功能。另一方面，为了支持肿瘤细胞的高增殖率，肿瘤需要迅速形成新的血管网络，不成熟的肿瘤血管对肿瘤微环境有着深远的影响，可导致缺氧、免疫细胞浸润和活性降低以及转移扩散风险增加[56]，抑制血管新生不利于肿瘤的生长和侵袭[57-58]。高水平的BACH1对胰腺癌细胞中PI3K/AKT/VEGF、ERK1/2、eNOS、HIF1A、PTEN等血管发育相关通路有抑制作用[55]，可以推测Bach1通过抑制肿瘤细胞血管新生，能够发挥一定的抑癌作用。但也有研究认为BACH1上调血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C, VEGFC)的转录活性，提高移植瘤内CD31+血管密度，促进肿瘤血管新生以及肿瘤转移[59]，提示BACH1对肿瘤血管新生也可能有双重作用，BACH1发挥作用的具体条件和机制还有待阐明。因此，明确BACH1功能的动态调控过程将有利于不同阶段的癌症针对性治疗。

5 总结与展望

关于BACH1的研究涉及氧化应激、细胞周期、血红素稳态、炎症和免疫等诸多方面。BACH1在血管内膜损伤修复、心梗和心肌肥厚等心血管疾病以及肿瘤中发挥重要作用，并且在不同的疾病以及病理生理状态下，BACH1发挥的作用是不同的。BACH1有调节脂肪细胞相关基因、糖酵解和氧化磷酸化等相关基因的作用，这表明BACH1可能影响代谢性疾病的发生和发展，而糖脂代谢紊乱也是影响心血管疾病发展的关键因素，因此BACH1与代谢性心血管疾病方面的研究值得探索。除此之外，BACH1参与的表观遗传修饰机制还有待进一步阐明。BACH1通过招募PRC2复合体来催化人胚胎干细胞的中胚层基因启动子区H3K27me3，从而抑制中内胚层基因的转录。然而，在小鼠胚胎干细胞中BACH1与H3K27me3没有共定位，可能是由于人和小鼠的胚胎干细胞多能性存在差异，导致BACH1依赖的共调节因子和表观遗传修饰发生了变化。在胚胎发育方面，之前的研究集中于分化早期BACH1的作用，关于BACH1在胚胎发育中后期，尤其是心血管系统发育过程中扮演的角色需要进一步研究。

总之，我们发现了BACH1在调控干细胞分化命运方面的特殊作用，阐明了干细胞多能性的维持机制，为干细胞在再生医学领域的应用提供可靠的理论依据。同时，我们认为BACH1是心血管疾病和转移性癌症的治疗靶点，根据不同的疾病状态和细胞类型设计BACH1靶向治疗方案，在临床上有着潜在的应用前景。