HPLC-MS/MS法测定枇杷中乙螨唑残留量及安全评价

王潇楠，常 虹，王思威，顾燕萍，孙海滨，刘艳萍

（广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640）

0 引言

枇杷(Eriobotrya japonica)是一类常绿特色果树，属于蔷薇科枇杷属，原产于中国东南部，栽培历史悠久，主要分布在四川、浙江、福建以及台湾等地区。枇杷富含多种营养元素且具有润肺止咳等医疗保健功效，可食用，也可药用。枇杷花期通常在秋冬时节，幼果越冬，在开花至果实成熟的过程中，会受到炭疽病、叶斑病等病害以及枇杷黄毛虫、枇杷红蜘蛛（比哈小爪螨）等虫害影响，导致其产量和品质下降[1-2]。目前在枇杷上登记的杀虫剂仅有甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和高效氯氟氰菊酯2种[3]，登记农药无法满足实际生产中虫害防治需要。

乙螨唑(etoxazole)属于二苯基噁唑啉杀虫剂[3-4]，主要通过抑制螨类的蜕皮和繁殖进而选择性触杀，是一种高效低毒的杀螨剂[5]，对于苹果、草莓、李子、樱桃、柑橘、番茄、茄子等多种作物上的螨虫防治效果优异[6-8]，但在枇杷上尚未登记。农药残留专家联席会议(JMPR)定义其残留物为乙螨唑[9]。

目前，对于乙螨唑的研究主要集中在储藏稳定性[10]、毒力评价[11-12]、残留分析检测方法[13-15]和消解行为研究等方面[16-17]。左巍等[14]建立了分散固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱(DSPE/UPLC-MS/MS)快速检测柑橘中乙螨唑及其代谢物的分析方法。官帅等[15]建立了土壤与苹果中乙螨唑残留量的气相色谱-质谱联用(GC-MS)测定方法。牛艳等[16]采用高效液相色谱(HPLC)测定乙螨唑在枸杞上的残留与消解动态。孙大利等[17]研究了柑橘中乙螨唑的代谢途径和毒理学机理，并评估乙螨唑对人体的慢性风险。未见枇杷上乙螨唑残留的相关报道。

本研究建立乙螨唑在枇杷上的高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)测定方法，并基于此方法研究乙螨唑在枇杷上的残留行为和消解动态，以期为乙螨唑在枇杷安全合理使用及最大残留限量(MRL)的制定提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LCMS-8045型高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（岛津SHIMADZU，日本）；GTR22-1型离心机（时代北利，中国北京）；XW-80A型涡旋仪（精科，中国上海）；ULTRA-TURRAXT 25型匀浆机（艾卡IKA，德国）；电子分析天平，SHANGPING，型号为FA2004，0.0001精度；电子天平，岛津SHIMADZU，型号为TXB622L，0.01精度。

98.6 %乙螨唑(etoxazole)标准品，CHEM SERVICE公司；20%乙螨唑悬浮剂(SC)，山东省绿士农药有限公司。乙腈：色谱纯；氯化钠：分析纯；二次蒸馏水。N-丙基乙二胺(PSA)净化剂40～60 μm，博纳艾杰尔；十八烷基键合硅胶(C18)净化剂，Agela Techlogies。

1.2 田间试验方法

1.2.1 田间试验设计 于2019年4—7月在广东、福建、四川、广西、浙江、云南6地开展了乙螨唑在枇杷上的最终残留试验，其中广东和四川开展了乙螨唑在枇杷上的消解动态试验。6地的品种分别为‘小叶枇杷’、‘早钟6号’、‘大五星’、‘长红3号’、‘白沙’和‘大五星’。每2棵枇杷树为一小区，3次重复，同时设置有空白对照（清水喷施），不同小区间布置有保护带。

1.2.2 残留消解动态试验 此项试验的设计与1.2.1一致，20%乙螨唑SC按100 mg/kg的剂量喷施，在末次施药后0(2 h)、1、3、7、14、21、28天经随机方式采集12个（不少于2 kg）枇杷[18-19]。

1.2.3 最终残留试验 最终残留试验设置高(50 mg/kg)、低(33.3 mg/kg)2个喷药剂量处理，每个处理重复3次。在果实成熟前35天左右时进行第1次喷雾施药，分别施药2、3次，施药间隔为7天，分别在最后一次施药后0(2 h)、14、21、28天时随机采样[18-19]。

1.3 分析方法

1.3.1 样品制备 将田间样品去除果柄后，计个数并称量。切开，取出果核并称重。将去掉果核后的样品切碎、混匀、缩分，移至样品容器内，贴好标签，-20℃冰箱存放，以备分析。

1.3.2 样品前处理 称取10 g（精确至0.01 g）匀浆处理后的枇杷样品至100 mL离心管中，加入40 mL乙腈，振荡3 min；加入5 g氯化钠，涡旋振荡3 min，4000 r/min离心5 min；吸取上清液4 mL氮吹近干，用2 mL甲醇定容，再移至内含0.01 g C18与0.05 g PSA的离心管内，涡旋振荡0.5 min，8000 r/min离心3 min，过0.22 μm有机滤膜，HPLC-MS/MS测定。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件：色谱柱为Shim-pack GIST-HP C18(100 mm×2.1 mm，3 μm)；流速 0.3 mL/min；进样量1 μL，柱温35℃；流动相为0.1%甲酸水[含2 mmol/L乙酸铵]:乙腈=10:90(v/v)；分析时间3.5 min。

（2）质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式；参数设定为雾化气流量、加热气流量、干燥气流量依次为3、10、10 L/min；另加热块温度、接口温度与DL温度依次为400℃MRM、300℃、250℃。多反应监测模式。其余质谱参数如表1所示。

表1 乙螨唑主要质谱参数

1.4 膳食风险评估

依据《中国不同人群消费膳食分组食谱》，同时参考残留化学评估推荐的规范残留试验中值(STMR)与已制定的最大残留限量(MRL)，计算乙螨唑的NEDI，通过与每日允许摄入量(ADI)进行比较，计算风险概率(RQ)，NEDI和RQ的计算如式(1)～(2)[20-23]。

式中，STMR指规范残留试验中值(mg/kg)，Fi为普通群体此作物的消费量(kg)，b.w.指国内人均体重(kg)。

对NEDI进行计算时，若无适宜的STMR值，可由相应MRL值替代[21]。若RQ在100%以内，表明此农药残留对一般人群健康不会产生不可接受的慢性风险。

2 结果与分析

2.1 方法的回收率、精密度和最低检测浓度

准确称取10 mg（精确到0.1 mg）乙螨唑标准品，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，配制成质量浓度约为1000 mg/L的标准储备液，稀释配制成10 mg/L的标准工作液。

用空白枇杷样品的提取液稀释上述标准工作液，配成质量浓度分别为0.005、0.010、0.050、0.100、0.500 mg/L基质匹配混合标准工作溶液，按1.3.2节条件测定，外标法定量，以进样质量浓度(x)为横坐标，相应的峰面积(y)为纵坐标，绘制基质标准曲线。在0.005～0.5 mg/L范围内，乙螨唑线性回归方程为y=3×108x-476075(R2=0.9992)，具有良好的线性关系，符合外标法定量分析要求。

从表2可看出，当添加水平在0.01～1.0 mg/kg范围内，乙螨唑在枇杷上平均回收率为89.2%～97.1%，RSD为3.4%～5.3%，LOQ为0.01 mg/kg，符合残留分析要求。

表2 乙螨唑在枇杷上的添加回收率及相对标准偏差(n=5)

2.2 乙螨唑在枇杷上的消解动态

2019年分别在广东和四川进行枇杷的消解试验，20%乙螨唑SC按100 mg/mg的剂量于果实生长至半大时喷雾施药1次，施药后0(2 h)、1、3、7、14、21、28天分别采集枇杷样本，结果见表3。如图1所示，施药后随时间增加，枇杷样品上乙螨唑的残留量表现出不断减少趋势，施药后28天残留消解率超过了90%，半衰期为6.9～8.9天。

图1 乙螨唑在枇杷上的残留与消解动态曲线

2.3 乙螨唑在枇杷中的最终残留量

2019年在广东、福建、四川、广西、浙江、云南6地开展了乙螨唑在枇杷上的最终残留试验，20%乙螨唑SC分别按33.3、50 mg/kg的剂量各喷施2次和3次，施药间隔期7天，依次在末次施药后0(2 h)、14、21、28天采样测定。试验结果见表3。各试验地点的样品中乙螨唑的残留量有所不同，这可能与各地枇杷的品种、气候条件、温湿度等差异性有关。随着采收间隔期的延长乙螨唑在枇杷上的残留明显下降，残留量基本正向相关于施药次数与施药剂量。

表3 乙螨唑在枇杷中的最终残留量

表3 乙螨唑在枇杷上消解动态方程

国内制定乙螨唑在仁果类水果（苹果除外）的MRL值为0.07 mg/kg[24]，国际食品法典委员会(CAC)制定乙螨唑在仁果类水果的MRL值为0.07 mg/kg[25]，欧盟制定的乙螨唑在枇杷上的MRL值为0.07 mg/kg[26]。因此，建议20%乙螨唑SC在枇杷上使用，施药剂量不超过33.3 mg/kg，安全间隔期为21天。

2.4 膳食风险评估结果

参考食品安全国家标准所制定的食品中MRL值，乙螨唑的ADI值是0.05 mg/(kg·bw)[24]。在国内，乙螨唑在棉花、柑橘、苹果、枸杞、咖啡豆等作物上获得了登记[3]。乙螨唑在棉籽上的MRL值为0.2 mg/kg[27]（日本，中国未制定），柑橘为0.5 mg/kg，枸杞为0.2 mg/kg，咖啡豆、苹果均为0.1 mg/kg[24]。参考调查居民人均膳食结构的结果，遵循风险最大化的原则，选用采收间隔期21天枇杷上乙螨唑留中值0.12 mg/kg对乙螨唑进行风险评估，一般人群水果的消费量(Fi)为0.0457 kg。通过式(1)计算出乙螨唑的NEDI为0.0126 mg，再基于国内的人均体重水平(63 kg)以及乙螨唑的ADI值，计算出风险商为0.4%。由此可见，按照推荐剂量33.3～50 mg/kg使用20%乙螨唑SC，对一般人群健康不会产生不可接受的风险。

3 结论

试验建立了HPLC-MS/MS检测枇杷上乙螨唑的残留分析方法，当添加水平在0.01～1.0 mg/kg范围内，乙螨唑在枇杷上平均回收率为89.2%～97.1%，RSD为3.4%～5.3%，LOQ为0.01 mg/kg，符合残留分析要求。

广东、四川二地消解动态试验结果表明，乙螨唑在枇杷上的残留消解符合一级反应动力学方程，半衰期为6.9～8.9天。喷雾施药后2 h，乙螨唑在枇杷果实上的检出量为0.17～0.45 mg/kg，28天后降解率＞90%。试验期间6个地区的最终残留试验结果显示，枇杷果实上乙螨唑的残留量基本正相关于施药次数以及施药剂量，随着采收间隔期的延长乙螨唑在枇杷上的残留量明显下降。

膳食风险评估结果显示，乙螨唑的NEDI是0.0126 mg，RQ是0.4%，对一般人群健康不会产生不可接受的风险。

建议枇杷上施用20%乙螨唑SC时，施药剂量不超过33.3 mg/kg，施药次数不超过2次，安全间隔期21天。

4 讨论

参考QuECHERS方法，以乙腈为提取溶剂，PSA和C18为净化剂，HPLC-MS/MS检测，其净化效果以及回收率均符合农药残留分析的要求。该方法操作简便快速，有机溶剂用量少，适用于样品批量处理。

农药在作物上的残留行为受多种因素影响，主要因素有农药自身理化性质、植物代谢归趋、降雨温度等气候条件、果实生长速度快慢对农药的释释作用等。乙螨唑在广东、四川枇杷上的的消解半衰期为6.9～8.9天，在宁夏、甘肃枸杞上的半衰期为5.0～6.4天[15]，在山东、河南苹果上的半衰期为7.4～14.2天[17]，在浙江、湖南、福建柑橘上的半衰期为5.6～7.6天[28]，乙螨唑在枇杷上的半衰期与其在枸杞、苹果、柑橘上相似，可见乙螨唑降解速度较快，属于易降解类农药（t1/2＜30天）。

国内规定乙螨唑在仁果类水果（苹果除外）上的MRL值为0.07 mg/kg，没有针对枇杷制定限量。CAC规定乙螨唑在仁果类水果的上MRL值也是0.07 mg/kg。欧盟制定乙螨唑在枇杷上的MRL值为0.07 mg/kg。农药MRL标准确立直接关系到农产品质量安全、公众身体健康保障、农产品与食品公平贸易的发展，《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》(GB 2763—2021)[24]中所制定的限量，基本来源为国内农药登记残留试验数据，对过去国行标的转化、CAC限量转化等。乙螨唑在仁果类水果的限量与CAC的限量一致，该限量值是否符合国内枇杷病虫害发生和农药应用的生产实际，有待于进一步试验研究。