过敏性紫癜患儿血清降解单糖水平的变化及意义

王志亮 盛楷迪 林毅 张秋业 张丽娟 常红

（1.青岛大学附属医院儿童肾脏风湿免疫科，山东青岛 266003；2.青岛大学附属妇女儿童医院，山东青岛 266003；3.青岛大学附属医院系统生物医学中心，山东青岛 266003）

过敏性紫癜（Henoch-Schönlein purpura，HSP）是一种常见的、由IgA为主的免疫复合物所介导的系统性血管炎［1］。该病在任何年龄均可发病，多见于儿童。其典型临床特征是非充血性可触性皮疹（紫癜样皮疹），伴关节肿痛、腹痛或肾脏受累［2］。研究表明HSP和紫癜性肾炎（Henoch-Schönlein purpura nephritis，HSPN）患者血清IgA1分子存在糖基化异常，其具体部位位于IgA1分子铰链区的连接O-聚糖，表现为唾液酸基与半乳糖基减少。异常IgA1分子无法及时清除，并诱发自身免疫、产生抗异常IgA1抗体，形成免疫复合物，沉积于靶器官引起炎性反应［3-5］。糖基化是糖链基团在糖基化酶的控制下对蛋白的重要修饰，异常糖基化与糖链基团的变化密不可分，而血清中降解单糖的含量变化在一定程度上是糖链基团数量和聚糖结构变化的反映［6］。青岛大学附属医院系统生物学张丽娟实验室利用高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography，HPLC），即PCR仪辅助酸解法分析血清多糖的单糖组成［7］，申请了检测血液中单糖组分（游离单糖或降解单糖 ） 的 专 利 技 术 （CN20140211976.3，CN201710394424.4，CN201810298226），这一技术被称为“糖指纹”，意为每一种不同疾病都有自己独特的血清单糖浓度变化。将复杂的糖链基团结构降解为单糖组分，简单快捷地测定血清中单糖含量，完成成分的定性和定量测定，结果准确稳定。张丽娟实验室利用糖指纹技术发现血清单糖组分在结直肠癌中的变化及意义［8］。目前尚无应用糖指纹技术探索单糖组分在HSP患儿中临床意义的研究报道。

本研究采用HPLC分析HSP患儿血清降解单糖浓度，探讨血清降解单糖与HSP的联系，寻找潜在的糖类生物标志物，并分析降解单糖对HSP诊断的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

前瞻性选取2019年9月至2022年1月就诊于青岛大学附属医院儿童肾脏风湿免疫科的132例HSP患儿为研究对象，所有患儿均符合儿童HSP的诊断标准［9］。另选取在我院体检的健康儿童132例为对照组。2组患儿性别、年龄、体重指数比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。该研究通过青岛大学附属医院医学伦理委员会审批（QYFYWZLL26176）。

表1 HSP组与对照组基础资料比较

1.2 样本采集

采集HSP患儿及健康体检儿童空腹（餐后6 h）外周静脉血4 mL于无菌促凝管，离心后取200μL上清液移于-80°C冰箱统一保存备检。

1.3 实验仪器与试剂

高效液相色谱仪（Agilent1260）购自美国Agilent公司。标准品：鼠李糖（l-rhamnose monohydrate，Rha）、葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man）、氨基半乳糖（galactosamine，GalN）、氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）、N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcUA）、半乳糖（galactose，Gal）、木糖（xylose，Xyl）、岩藻糖（fucose，Fuc）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-1,2-dihydropyrazol-3-one，PMP）、氯仿购于美国SIGMA-ALDRICH公司。乙腈、甲醇为色谱纯，氢氧化钠溶液、盐酸溶液、乙酸铵、冰醋酸为分析纯。

1.4 PCR仪辅助酸解法分析血清多糖的单糖组成实验方法

5μL血清加入5μL（1 mg/mL）Rha、10μL（6 mol/L）盐酸溶液，运行PCR酸解程序（90 s内升温至100℃，保持10 min后于120 s内冷却至4℃），加入20μL（3 mol/L）氢氧化钠溶液、20μL（0.5 mol/L）PMP后放入PCR仪中运行PCR衍生程序（70℃保持40 min后冷却至4℃保持10 min），加入20μL乙酸铵缓冲溶液、100μL氯仿萃取后放入离心机（13 300 r/min，15 min），取50μL上清液待HPLC分析。

1.5 HPLC检测条件

检测波长254 nm，带宽4 nm，参比波长350 nm，带宽100 nm，柱温37℃，流速1 mL/min，进样体积20μL。流动相：100%乙腈和乙酸铵缓冲溶液（pH=5.5）。梯度模式：时间梯度：0➝10➝15➝20 min；乙腈的浓度梯度：15%➝22%➝24%➝15%；乙酸铵缓冲溶液（pH=5.5）的浓度梯度85%➝78%➝76%➝85%。

1.6 单糖标准曲线及线性回归方程式

标准单糖混合溶液等梯度浓度稀释为10个梯度。将不同浓度梯度的单糖标准品混合液通过HPLC分析得到单糖标准品的HPLC色谱图（图1）。将单糖标准品的浓度作为横坐标，对应的峰面积作为纵坐标，得到对应的单糖标准曲线及相应的方程式（表2）。血清样品通过HPLC分析得到HPLC色谱图，因此得到HSP组和对照组儿童血清降解得到的9种单糖浓度（图2）。因未检测到血清GlcUA、GlcNAc、Glc、Xyl、Fuc的浓度在HSP组与对照组差异有统计学意义，所以本研究主要讨论HSP患儿血清中Man、GlcN、GalN和Gal与疾病的关系。标准品血清内加入浓度一致的Rha，用于监测血清中有无其他内源性物质干扰单糖的测定。

图1 10种单糖标准品HPLC色谱图 ［PMP］1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮；［Man］甘露糖；［GlcN］氨基葡萄糖；［Rha］鼠李糖；［GalN］氨基半乳糖；［GlcUA］葡萄糖醛酸；［GlcNAc］N-乙酰氨基葡萄糖；［Glc］葡萄糖；［Gal］半乳糖；［Xyl］木糖；［Fuc］岩藻糖。a为衍生试剂峰；b为单糖内标试剂峰。

表2 单糖标准品的线性回归方程式

图2 血清样品降解单糖HPLC色谱图 ［PMP］1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮；［Man］甘露糖；［GlcN］氨基葡萄糖；［Rha］鼠李糖；［GalN］氨基半乳糖；［GlcUA］葡萄糖醛酸；［GlcNAc］N-乙酰氨基葡萄糖；［Glc］葡萄糖；［Gal］半乳糖；［Xyl］木糖；［Fuc］岩藻糖。a为衍生试剂峰；b为单糖内标试剂峰。

1.7 统计学分析

用SPSS 25.0统计学分析软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两样本t检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析Man、GlcN、GalN和Gal对HSP的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组血清4种单糖水平分析

HSP组患儿血清Man、GlcN、GalN和Gal浓度高于对照组（P<0.001），见表3。

表3 HSP组与对照组单糖水平比较（±s，μmol/L）

表3 HSP组与对照组单糖水平比较（±s，μmol/L）

注：［Man］甘露糖；［GlcN］氨基葡萄糖；［GalN］氨基半乳糖；［Gal］半乳糖；［HSP］过敏性紫癜。

组别对照组HSP组t值P值例数132 132 Man 2.78±0.35 3.56±0.58 13.27<0.001 GlcN 2.28±0.34 3.02±0.54 13.28<0.001 GalN 1.05±0.19 1.33±0.22 10.94<0.001 Gal 2.11±0.27 2.83±0.51 14.50<0.001

2.2 4种单糖的ROC曲线分析

ROC曲线分析显示，HSP患儿除GalN的曲线下面积（area under curve，AUC）为0.823外，Man、GlcN和Gal的AUC均>0.9，三者均对HSP有较好的诊断价值（P<0.001），见图3、表4。

图3 血清4种单糖ROC曲线 ［Man］甘露糖；［GlcN］氨基葡萄糖；［GalN］氨基半乳糖；［Gal］半乳糖。

表4 血清单糖水平诊断HSP的ROC曲线分析

3 讨论

糖蛋白在机体内承担着重要功能，如结构、转运、酶促反应等，特别是在免疫系统。免疫球蛋白都属于糖蛋白，而糖基化修饰对于蛋白发挥正常功能具有重要意义。糖链基团是一类分子结构复杂且庞大的多糖，由多种结构相同或不同的单糖通过糖苷键结合而成［10］。糖组学是当前生物学领域的新兴学科，主要研究多糖在生物体内的结构和功能。近年来随着糖组学和糖蛋白组学的发展，糖链基团在免疫及免疫系统疾病中的功能机制及作用逐渐成为免疫学的研究热点［11］。但是与核糖核酸和蛋白质不同的是，糖链基团的合成没有模板，且易受环境的影响；目前对糖链基团的多糖结构的解析需要昂贵的仪器和复杂的多糖制备程序，这使得糖链基团的基础研究结果在现阶段难以转化为临床应用。

单糖是糖基化蛋白中糖链基团的最小组成单位，与异常糖基化密切相关，单糖浓度在一定情况下可以反映糖链基团异常改变的程度。将复杂的糖链基团的多糖结构降解为单糖，分析复杂糖链基团的单糖组成可能会是一种新的临床应用方向。糖链基团的多糖结构降解后由以下11种单糖组成，即Man、GlcUA、GlcNAc、Glc、Xyl、Fuc、GlcN、GalN、Gal、艾杜糖醛酸和唾液酸［7-8］。本研究采用的HPLC分析HSP患儿血清单糖水平，相比较于质谱法，HPLC仅需5μL患儿血清20 min即可完成样品检测，一次性可得到9种单糖浓度，且结果可重复性好。

HSP可有皮肤、关节、胃肠道、肾脏等多个器官及系统受累，肾脏损害是影响HSP预后的关键因素［12］。有研究表明HSP、HSPN患者血清中半乳糖 缺 陷IgA1（galactose-deficient IgA1，Gd-IgA1）水平显著升高，而Gd-IgA1诱发自身免疫反应产生的抗体可与Gd-IgA1结合并形成免疫复合物，目前公认这是HSP及HSPN发病的关键机制［13］。人类血清免疫球蛋白IgA有2个亚型：IgA1和IgA2，其中IgA1铰链区的N-聚糖是由N-乙酰氨基葡糖的β-碳原子与天冬酰胺的酰胺基结合，而IgA1分子不仅有4条N-聚糖，而且还有多达10条的O-聚糖，其基本结构是由N-乙酰氨基半乳糖与铰链区多肽骨架上的苏氨酸或者丝氨酸的羟基结合形成，而Gal可通过形成β1,3键连接至N-乙酰氨基半乳糖上，构成Galβ1,3GalNAc，从而使糖链延长。因种种因素，HSP与HSPN患者血清中IgA1糖链基团脱中半乳糖丰度显著下降，而此种Gd-IgA1可使IgA1免疫原性发生改变，从而诱发自身免疫反应，产生抗自身多糖抗体，导致循环免疫复合物的形成，循环免疫复合物可沉积于系膜区，从而引起HSP患儿肾损伤。健康人群血清中IgA1亦含有少量半乳糖缺陷的O-聚糖；而HSPN患者Gd-IgA1比例显著增高［14］。

因血清GlcUA、GlcNAc、Glc、Xyl、Fuc的浓度在HSP组与对照组中差异无统计学意义，所以本研究主要讨论血清中Man、GlcN、GalN和Gal与HSP的关系。已有的研究显示HSP患儿Gd-IgA1比例增高［14］，本研究测得HSP患儿血清Gal浓度高于对照组，可能与HSP患儿异常糖基化有关；本研究也显示HSP患儿的血清Man、GlcN、GalN浓度高于对照组，这提示Man、GlcN、GalN相关的异常糖基化可能参与了HSP的发生发展。ROC曲线分析显示HSP患儿血清Man、GlcN、GalN和Gal的曲线下面积分别为0.919、0.913、0.832和0.932，提示患儿血清Man、GlcN、GalN和Gal可能是诊断及作为监测HSP发生发展的灵敏指标。因PCR仪辅助酸解法分析血清多糖的单糖组成的实验方法降解到的血清单糖为血清中几乎所有糖蛋白糖链的单糖，所以我们暂时不能确定HSP患儿血清中Gal浓度的升高是否完全来源于Gd-IgA1；同样HSP患儿血清Man、GlcN、GalN的浓度升高原因暂时不明，需进一步的研究证实。且本研究为单中心的研究，只针对HSP患儿和对照组儿童的血清单糖浓度进行检测，并无其他疾病儿童对照，如IgA肾病儿童，血清Man、GlcN、GalN、Gal是否可作为HSP独有的血清标志物仍需进一步研究证实。

综上所述，HSP患儿血清Man、GlcN、GalN、Gal浓度显著高于健康儿童，可能与HSP患儿血清异常糖基化有关，提示HSP患儿降解单糖的水平对疾病的诊断可能具有重要价值，但是否可以成为临床诊断及检测HSP发生发展的独特标志物尚需进一步研究。

利益冲突声明：所有作者均声明无利益冲突。