广东省猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定及耐药表型和耐药基因检测与分析

徐民生，柯海意，施科达，杨冬霞，翟少伦，臧莹安，李春玲

(1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广州 510305；2.广东省农业科学院动物卫生研究所,广东省畜禽疫病防治研究重点实验室,农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广州 510640)

中国是世界上重要的猪肉生产国和消费国，广东省作为全国重要的产猪大省，其规模和出栏量均位于全国前列。自2019年国家农业农村部准备实施“饲料禁抗”政策以来，传统养殖模式的改变也加大了病原菌在养殖场内传播的风险[1-2]。在引起猪呼吸道疾病的几类传染病中，由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumia，PCP)在世界范围内造成了较高的发病率和死亡率[3]。APP是一种定植于猪上呼吸道的革兰氏阴性、无运动的杆状细菌，主要导致发病猪出现急性或慢性的坏死性-纤维素性胸膜肺炎，给养猪业造成重大的经济损失[4]。

根据 APP 生长对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的依赖性，将其分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型[5]。同时以荚膜多糖的抗原特性将该物种分为19种血清型,众多的血清型及区域流行的差异、暂无高效安全的疫苗及耐药菌株的出现，给APP的防控和治疗带来了巨大的挑战[6-7]。发病猪被认为是最主要的传染源，且在<1 m的短距离中APP也会随着空气进行传播，所有年龄的猪均会感染，特别是3月龄的育肥猪最易感染，且通常会导致较高的发病率和死亡率[8-9]。使用抗生素是目前最主要的预防和治疗手段，但抗生素的滥用导致APP对常用抗生素的耐药性(AMR)日益严重，且越来越多的多重耐药菌株也为临床治疗和防控该疾病带来了很大困扰[10]。已有研究表明，对猪的最佳治疗和谨慎使用抗生素是防止关键耐药性发展和确保动物健康的必要条件,某些细菌的耐药性也会随着使用情况和时间的推移发生变化[11]。因此，对猪致病菌耐药性的持续监测显得十分必要。

为了解和掌握近3年广东省内规模化猪场APP感染和耐药的情况，本研究以疑似APP感染病猪为研究对象，分别进行APP的分离鉴定、药敏试验及耐药基因的检测，并进一步分析耐药表型和耐药基因的关系，以期为临床上防治APP提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品及菌株 2019-2021年采集广东省不同地区不同规模化猪场疑似感染猪传染性胸膜肺炎的病死猪的肺脏、肝脏等组织。

1.1.2 主要试剂及仪器 胰蛋白大豆琼脂培养基(TSA培养基)、胰蛋白大豆肉汤培养基(TSB培养基)、普通绵羊血平板(广东环凯微生物科技有限公司)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(北京索莱宝科技有限公司)；小牛血清(广州蕊特生物科技有限公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒、2×rTaqMix、DL2000 DNA Marker(TaKaRa公司)；革兰氏染液、生化反应管和药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)。

电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司产品)；PCR仪(杭州晶格科学仪器有限公司)；电泳仪(北京市六一仪器厂)；显微镜(OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养及形态观察 无菌采集病死猪组织病料，使用接种环无菌接种于TSA固体培养基(含10%小牛血清及0.1% NAD)上，于37 ℃过夜培养，观察并记录菌落形态，挑取疑似单菌落接种于TSB液体培养基中进行纯化培养。并对纯化后的菌落进行涂片和革兰氏染色，在显微镜下观察并记录菌体形态。

1.2.2 生化鉴定试验 将分离菌株的液体培养物分别接种于添加了0.1% NAD的生化反应管中，37 ℃培养24 h，观察其生化反应特性并按照说明书进行鉴定。

1.2.3 APP菌种的PCR鉴定 参考王海丽等[12]合成APP菌种特异性靶基因OmlA的引物。引物序列为：F：5′-AAGGTTGATATGTCCG-CACC-3′；R：5′-CACCGATTACGACTTGCC-3′，预期扩增片段长度为952 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用试剂盒提取DNA并以此为模板进行PCR反应。PCR 反应体系25 μL：2×rTaqMix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，回收阳性PCR产物，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.4 相似性及进化树分析 将测序结果在GenBank进行BLAST比对。选取NCBI数据库中与APP相似性相近的10条序列(表1)，用Mega 7.0 软件对选取的序列进行编辑，并构建系统进化树。

表1 参考菌株信息

1.2.5 药敏试验 采用K-B药敏纸片法对分离菌株进行药敏试验。将分离菌株接种至含有10%小牛血清及0.1% NAD的TSB培养基中，制成含菌量约为0.5麦氏浊度的菌悬液，吸取100 μL并用无菌棉签均匀涂布于TSA平板(含0.1% NAD和10%小牛血清)表面，待液体吸干后用无菌镊子夹取抗生素药敏纸片贴在平板表面，置于37 ℃温箱中培养30 min，后倒置培养12～18 h，记录抑菌圈直径并参照杭州微生物试剂有限公司提供的判断标准，判定分离菌为耐药(R)、中介(I)和敏感(S)。

耐药率(%)=对某种抗菌药物耐药的菌株数/总菌株数×100%

耐药表型率(%)=对某类抗菌药物耐药的总菌株数/检测某类抗菌药物的总菌株数×100%

1.2.6 耐药基因检测 利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组总DNA作为PCR反应模板，于-20 ℃保存备用。根据细菌耐药情况及参考相关文献[13-19]报道，设计合成7类23种耐药基因引物并进行检测，包括：β-内酰胺类blaCMY、blaOXA、blaSHV、blaTEM基因；氨基糖苷类ant(6′)-Ⅰa、aph(2″)-Ⅰb、aph(2″)-Ⅰc和aph(2″)-Ⅰd基因；大环内酯类和林可胺类mefA、ermA、ermB基因；磺胺类sul1、sul2和sul3基因；四环素类tetA、tetB、tetM、tetO和tetR基因；喹诺酮类gyrA和parC基因；氯霉素类floR和fexA基因。引物信息见表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系25 μL：2×rTaqMix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性10 min；95 ℃变性40 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共40个循环；72 ℃延伸 10 min，PCR 产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

耐药基因携带率(%)=对某种耐药基因的阳性菌株数/总菌株数×100%

耐药基因平均携带率(%)=对某类抗菌药物的总携带率/某类抗菌药物耐药基因总数×100%

耐药基因与耐药表型相符率(%)=耐药基因平均携带率/耐药表型率×100%

表2 耐药基因引物信息

续表

2 结 果

2.1 细菌分离结果

在TSA(含NAD)平板上分离出圆形、小而透明的露珠样黏液型菌落(图1)，革兰氏染色结果显示分离菌为革兰氏阴性菌，多成短杆状，两极着色明显(图2)，共获得20株分离菌。

图1 分离菌菌落形态Fig.1 Colony morphology of the isolated bacteria

图2 分离菌革兰氏染色结果(1 000×)Fig.2 Gram staining results of the isolated bacteria (1 000×)

2.2 生化试验结果

生化试验结果显示，20株分离菌对葡萄糖、木糖、果糖、蔗糖、甘露醇、尿素酶和硝酸盐还原酶的反应为阳性；蕈糖、棉子糖、血清菊糖、山梨醇、水杨素和七叶苷反应为阴性(表3)。生化试验结果与APP生化特性一致，可初步确定分离菌为APP。

表3 20株临床分离菌株生化鉴定结果

2.3 分离菌株PCR鉴定

采用针对APP菌种的特异性引物进行OmlA基因扩增，结果显示，分离株均获得长度为952 bp的特异性条带(图3)，与预期结果相符。本试验共成功分离到20株APP，分别将其命名为GD1901～GD1908、GD2009～GD2014、GD2115～GD2120，并保存于广东省农业科学院动物卫生研究所猪病研究室。

M，DL2000 DNA Marker；-，阴性对照；+，阳性对照；1～20，分离株M，DL2000 DNA Marker;-，Negative control;+，Positive control;1-20,The isolates图3 分离株OmlA基因PCR鉴定结果Fig.3 PCR identification results of OmlA gene of the isolates

2.4 序列相似性及系统进化分析

20株APP分离菌株经OmlA基因扩增后进行测序，将测序结果与参考菌株进行序列相似性分析，结果显示，分离菌株与已发表的10株APP序列相似性在98%～100%之间。系统进化分析结果显示，APP广东分离株GD1904、GD2119、GD1905、GD2117、GD2118、GD2116与APP瑞士分离株WF83和德国分离株AP76亲缘关系较近，聚成一簇，并与中国分离株JL03和美国分离株NCTC11384处在同一分支；GD1901、GD1902、GD1903进化关系较近，并与巴西分离株MV279和加拿大分离株L20处在同一分支；GD1906、GD1907亲缘关系较近，GD2115、GD2009、GD2011、GD2014、GD2010、GD2012、GD2013的进化关系较近，促成一簇并与丹麦分离株NCTC10976和爱尔兰分离株S405处在同一分支；GD1908和GD2120都与韩国分离株KL16处在同一分支(图4)。

图4 APP分离株OmlA基因系统进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of OmlA gene of APP isolates

2.5 药物敏感性鉴定

药敏结果显示，分离的20株APP菌株对临床上常用的18种抗菌药物产生不同程度的多重耐药性，对青霉素、克拉霉素、磺胺异噁唑、四环素和林可霉素5种药物的耐药率最高，达到70%～100%；对氨苄西林、庆大霉素、链霉素、复方新诺明、多西环素和氟苯尼考6种药物的耐药率为30%～60%；对头孢拉定(先锋Ⅵ)、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻肟(凯福隆)、卡那霉素、红霉素、环丙沙星和恩诺沙星7种药物耐药率较低，为10%～25%；其中对头孢唑啉(先锋Ⅴ)、阿奇霉素2种药物敏感(表4)。

多重耐药情况的统计结果显示，分离菌均呈现多重耐药性(表5)。其中10重及以上耐药的菌株最多，有7株，占比达到35%，9重和8重耐药菌株占比分别达到10%和5%，由此可见约50%分离菌株为8重及以上耐药；6重和7重耐药菌株也较多，共有8株，占比达到40%；5重耐药菌株数占比较少，为10%。统计结果表明，分离的20株APP的多重耐药情况十分严重。

表5 APP临床分离株的多重耐药情况

2.6 耐药基因检测结果

耐药基因检测结果显示，20株APP中β-内酰胺类中blaCMY基因携带率最高，为85%(17/20)，blaOXA、blaTEM、blaSHV基因均未检测出；氨基糖苷类中aph(2″)-Ⅰb基因携带率最高，为85%(17/20)，aph(3″)-Ⅲa、ant(6′)-Ⅰa、aph(2″)-Ⅰc和aph(2″)-Ⅰd基因未检测出；氯霉素类中floR基因携带率最高，为80%(16/20)，未检测到fexA基因；磺胺类sul3基因携带率最高，为75%(15/20)，sul1和sul2耐药基因携带率分别为50%(10/20)和60%(12/20)；四环素类中tetB和tetO基因携带率最高，为100%(20/20)，tetM基因携带率为85%(17/20)，tetR基因携带率为70%(14/20)，tetA基因携带率为30%(6/20)；未检测出大环内酯类和喹诺酮类相关耐药基因。部分凝胶电泳结果见图5～7。

①A～C，分别为blaCMY、aph(2″)-Ⅰb和floR基因。②M，DL2000 DNA Marker；1～8，GD1901～GD1908；9～14，GD2009～GD2014；15～20，GD2115～GD2120。下同①A-C，blaCMY，aph(2″)-Ⅰb and floR genes,respectively；②M，DL2000 DNA Marker；1-8，GD1901-GD1908；9-14，GD2009-GD2014；15-20，GD2115-GD2120.The same as below图5 blaCMY、aph(2″)-Ⅰb和floR耐药基因PCR扩增结果Fig.5 PCR amplification results of blaCMY,aph(2″)-Ⅰb and floR resistance genes

A～C,分别为sul1、sul2和sul3基因A-C,sul1,sul2 and sul3 genes,respevtively图6 磺胺类耐药基因PCR扩增结果Fig.6 PCR amplification results of sulfonamides resistance genes

A～E,分别为tetA、tetB、tetM、tetO和tetR基因A-E,tetA,tetB,tetM,tetO and tetR genes,respectively图7 四环素类耐药基因PCR扩增结果Fig.7 PCR amplification results of tetracyclines resistance genes

2.7 耐药表型与耐药基因相关性

在检测的20株APP中，耐药表型不同程度地高于相应耐药基因的携带率(表6)。分离株对磺胺类和四环素类药物表现出较高程度的耐药性，同时磺胺类耐药基因(sul1、sul2和sul3基因)和四环素类耐药基因(tetB和tetO基因等)的阳性检出率也较高，表现较为一致，相符率达到94.9%和99.4%；β-内酰胺类、氨基糖苷类和的耐药表型和耐药基因的携带率均较低，为20%～40%；氯霉素类药物中针对氟苯尼考药物的耐药基因(floR基因)检出率较高，与药物的耐药表型也基本一致；而对大环内酯类、林可胺类和喹诺酮类没有检测到相关的耐药基因，但在表型上表现出一定的耐药率，分别为31.7%、100%和15%。

表6 分离株APP耐药基因与耐药表型相关性

3 讨 论

猪传染性胸膜肺炎被认为是世界范围内工业化养猪的三大呼吸道疾病之一[20]，目前商业疫苗只能提供有限的保护，抗生素的使用依然是临床上治疗该病的有效措施，但由于长期以来抗生素的滥用导致许多耐药菌株的出现[21]，世界卫生组织更是将耐药性列为世界公共卫生的三大威胁之一[11]。因此，进行流行病学跟踪以明确APP的耐药谱和耐药基因的携带率对临床上科学的指导用药和减少耐药性的产生具有重要意义。

本试验针对广东省不同地区猪场分离得到20株APP，经PCR扩增OmlA基因(OmlA基因为APP外膜脂蛋白的种特异性靶基因，可准确快速地鉴定细菌[12])鉴定后测序，测序结果与NCBI上选取的10株参考菌株进行BLAST比对，相似性达98%以上。进化树结果显示,分离株GD1904、GD2119、GD1905、GD2117、GD2118、GD2116与中国分离株JL03亲缘关系较近，处在同一分支；其他分离株分别与不同国家的APP分离株有进化关系，表明20株APP可能由于在地理位置上分布广，没有表现出明显的地域特性和物种特性。

本研究针对临床上常用的20种抗菌药，对分离株分别进行7大类23种耐药基因和耐药表型检测，结果显示，20株分离菌除了对阿奇霉素和头孢唑啉(先锋Ⅴ)完全不耐药外，对青霉素等其他抗菌药物均有不同程度的耐药性，对磺胺异噁唑、林可霉素和四环素高度耐药，耐药率为100%；对氨苄西林、庆大霉素等6种药物较耐药，耐药率为30%～60%；对阿莫西林/克拉维酸、头孢噻肟(凯福隆)等7种药物耐药率较低，为10%～25%。Kucerova等[22]报道捷克APP分离菌株对氟苯尼考、阿莫西林-克拉维酸药物耐药性较低，而对四环素耐药性较高，为23.9%；Kim等[23]和Archambault等[24]报道的APP分离菌株对氟喹诺酮类药物耐药性低；王丹丹等[21]检测苏中地区APP药敏结果显示，分离菌株对β-内酰胺类药物高度敏感，对链霉素耐药；余波等[25]分析贵州省APP耐药表型的结果显示，分离菌株对四环素及磺胺类药物耐药，但对氟苯尼考敏感。通过比较可发现，广东地区分离株的耐药表型与国内其他地区相似，但与国外差异较大，其中四环素类的耐药性大幅增加，氟苯尼考的耐药性也有所变化，这可能由于四环素耐药菌株的不断进化和临床上对氟苯尼考的使用频率加大导致APP菌对该药物的耐药率增加。耐药基因方面，本研究共检测到blaCMY、aph(2″)-Ⅰb、sul1、sul2、sul3、tetA、tetB、tetM、tetO、tetR和floR共11种耐药基因，四环素类的耐药基因tetB和tetO的携带率最高，达到100%；blaCMY、aph(2″)-Ⅰb、tetM和floR基因的携带率达到80%～85%；磺胺类耐药基因sul2和sul3、四环素类tetM基因和氟苯尼考中的floR基因检出率为60%以上。李海利等[16-17]报道河南省APP对四环素类耐药基因的最高检出率为78.8%，磺胺类耐药基因sul2的检出率为100%。对比发现本研究对四环素类耐药基因的检出率增加，这与前面药敏试验结果中对四环素类药物的耐药性较高表现一致；值得注意的是有些分离菌株对氟苯尼考不耐药，但仍然能检出floR基因。

本试验结果显示，耐药基因检出结果与耐药表型基本一致，表明耐药基因的携带是细菌对抗菌药物产生耐药的主要原因之一。但大环内酯类和喹诺酮类的耐药基因均未检测到，药敏结果却显示部分分离株对克拉霉素和恩诺沙星耐药，说明可能存在其他未检出的耐药基因，或其他尚未发现的耐药机制。

4 结 论

本研究检测分析了2019-2021年从广东省不同猪场分离到的20株APP耐药谱和耐药基因的携带情况。药敏结果显示，分离株对四环素类和磺胺类药物表现出广泛耐药，且为多重耐药；耐药基因检测结果显示，部分耐药菌株同时携带多种耐药基因，以tetB、tetO和floR等耐药基因为主。APP耐药机制复杂，结合耐药表型和耐药基因的检测，筛选敏感药物，可减少或避免耐药菌株的出现，对防治猪传染性胸膜肺炎有重要的实践意义。