褪黑素受体MT1和MT2在绵羊胃中的分布及表达

李卫东，蒋玉婷，段宏伟，何海军，杨 帅，丁自强，吴建新，张恩秋，胡俊杰

(1.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070；2.四川省广安市前锋区桂兴镇畜牧兽医站，广安 638500；3.定西市畜牧技术推广站，定西 743000)

褪黑素(melatonin，MT)是主要由松果体合成和分泌的一种吲哚类激素，对机体的生理功能具有广泛的调控作用[1-2],如抗氧化[3]、抗炎[4]、抗癌[5]、免疫调节[6]和生殖生理功能调节等[2]。在哺乳动物体内，褪黑素的多种调节作用是通过其高亲和力G蛋白耦联膜受体介导的，即MT1和MT2，且不同受体介导所发挥的调控机制可能不同[7]。目前，在人及大鼠等动物胃中研究发现，褪黑素具有影响胃动力、抑制胃酸和胃蛋白分泌、清除氧自由基、保护胃黏膜等多种功能[8-9]。而绵羊作为反刍动物，其消化系统极为复杂，各胃室功能差异较大[10]，在前期研究中已证实绵羊胃组织具有合成褪黑素的能力[11]，但其特异性膜受体MT1和MT2在绵羊胃组织中的表达规律尚待揭示。

基于褪黑素与胃组织特异性受体耦合发挥调控胃动力的机制，研究褪黑素激素受体在体内的分布及生物学特性对于阐明褪黑素的作用机制十分重要。本研究运用ELISA、实时荧光定量PCR、免疫组化(immunohistochemistry，IHC)和Western blotting等分子生物学方法，从基因和蛋白水平探明褪黑素膜受体MT1和MT2在绵羊各胃中的定位和定量变化规律，以期为进一步研究褪黑素对绵羊等反刍动物不同胃功能的调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 样品采自兰州市某屠宰场6只10～15月龄健康绵羊的全胃组织，液氮保存立即运回实验室，依次分离瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃4个胃室，再将瘤胃依据组织形态分离背囊和腹囊组织。部分样品用4%多聚甲醛溶液固定用于免疫组化检测，其余样品于-80 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂及仪器 兔抗MT1抗体购自PLIabs公司；兔抗MT2抗体购自Abcam公司；SP-0024 HistostainTM-Plus Kits免疫组化染色试剂盒和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(H+L)均购自北京博奥森生物技术有限公司；DAB显色液和阳离子防脱玻片均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；高效RIPA组织/细胞快速裂解液、TRIquick Reagent、PMSF和BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司；Go ScriptTMReverse Transcription System反转录试剂盒购自Promega公司；Trans Start Green qPCR Super Mix试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；绵羊褪黑素ELISA试剂盒购自上海颖心实验室。

移液枪购自Eppendorf公司；超低温冰箱、4 ℃离心机和ND2000紫外分光光度计均购自Thermo Fisher公司；实时荧光定量PCR仪购自Roche公司；垂直电泳槽、转膜槽均购自Bio-Rad公司；超微量核酸蛋白测定仪购自Pultton公司；SpectraMax i3x多功能酶标仪购自Molecular Device公司；正置显微镜购自Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 ELISA方法测定绵羊不同胃室组织中褪黑素含量 参照绵羊褪黑素ELISA试剂盒说明书，将样品置于预冷的含有50 mmol/L EDTANa2(pH 7.4)的PBS中，以9倍样品重量的体积进行匀浆处理，超声波破碎后4 ℃、3 000×g离心15 min，提取上清液并于-80 ℃保存。将瘤胃背囊、瘤胃腹囊、网胃、瓣胃、皱胃组织上清液加入包被好的96孔板中，设置标准品孔和样本孔，标准品孔加入已知浓度的标准液(S0-S5)50 μL。空白孔不加，样本孔加上清液10 μL，再加入Sample稀释液40 μL，除空白孔外，标准品孔和样本孔中加入 HRP标记的羊抗兔IgG 100 μL，于37 ℃温育60 min；弃去液体，拍干孔内液体后每孔加入洗涤液1 mL，震荡洗涤1 min，拍干，重复洗涤5次或以上。显色：除对照孔外其他每孔加入底物A、B各50 μL，置于37 ℃避光温育15 min。每孔加入终止液50 μL，在15 min内使用酶标仪于450 nm波长处测定各孔的D值。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测绵羊不同胃室组织中褪黑素膜受体mRNA的表达差异 将试验样品在液氮中快速研磨至粉状，分别称取500 g，加入1 mL Trizol裂解液提取总RNA，紫外分光光度计测定RNAD260 nm/D280 nm值及浓度。运用Go ScriptTMReverse Transcription System反转录试剂盒将提取的总RNA反转录为cDNA后于-20 ℃保存备用。

根据GenBank中公布的绵羊MT1和MT2受体mRNA序列，选用β-actin作为内参基因，用Primer Premier 5.0软件设计MT1、MT2和β-actin的引物(表1)。使用Trans Start Top Green qPCR Super Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增，设置3个重复组。PCR反应体系20 μL：Trans Start Green qPCR Super Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL， ddH2O补至20 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸2 min，共40个循环。

表1 引物信息

1.2.3 免疫组化检测绵羊不同胃室组织中褪黑素膜受体分布 将不同胃室组织切片于60 ℃烘箱内烘烤4 h，经脱蜡和柠檬酸钠煮沸抗原修复，按SP法免疫组化染色试剂盒说明书染色，一抗MT1(1∶400)和MT2(1∶400)4 ℃孵育过夜。二抗HRP标记链霉卵白素37 ℃孵育20 min后，DAB显色，苏木精复染2 min，用PBS漂洗，中性树胶封片，干燥后，在显微镜下观察、拍照。阴性对照一抗用PBS代替，其余步骤一致。

1.2.4 Western blotting检测绵羊不同胃室组织中褪黑素膜受体蛋白的表达差异 在液氮中将试验样品快速研磨至粉状，分别称取500 g，加入1 mL RIPA裂解液和10 μL PMSF(1 mmol/L)提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，取蛋白裂解液75 μL加入25 μL 4×Loading buffer，98 ℃变性10 min，进行SDS-PAGE，转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗MT1(1∶1 000)、MT2(1∶1 000)、β-actin(1∶3 000)4 ℃孵育过夜，PBST清洗5次，加入ECL发光液检测蛋白条带。

1.3 数据统计分析

用Excel对试验数据进行整理汇总，然后运用SPSS 17.0软件对褪黑素含量及MT1和MT2基因和蛋白的相对表达量进行单因素方差分析和邓肯氏多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 绵羊不同胃室组织中褪黑素含量测定结果

ELISA检测结果显示，在绵羊瘤胃背囊、瘤胃腹囊、网胃、瓣胃和皱胃中均检测到了褪黑素，依次为0.69、0.66、0.52、1.10和1.55 pg/mL，皱胃中含量最高，显著高于其他胃室(P<0.05)，瓣胃中含量显著高于瘤胃背囊、瘤胃腹囊和网胃(P<0.05)(图1)。

肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below图1 绵羊不同胃室组织中褪黑素的含量Fig.1 Content of melatonin in different stomachs of sheep

2.2 绵羊不同胃室组织中褪黑素膜受体mRNA的表达

由图2可知，在绵羊的各胃室组织中均检测到褪黑素受体MT1和MT2 基因mRNA。皱胃中MT1和MT2基因mRNA表达量最高，显著高于其他胃室(P<0.05)；其次是瘤胃腹囊，显著高于瘤胃背囊、网胃和瓣胃(P<0.05)，瘤胃背囊的表达量最低，而MT1基因mRNA在瓣胃中的表达量显著高于瘤胃背囊和网胃(P<0.05)，MT2基因mRNA在瓣胃中的表达量显著高于瘤胃背囊(P<0.05)。

图2 绵羊不同胃室组织中MT1和MT2基因mRNA的相对表达量Fig.2 Relative expression of MT1 and MT2 gene mRNA in different stomachs of sheep

2.3 绵羊不同胃室组织中褪黑素膜受体分布

由图3可知，MT1和MT2分布在绵羊不同胃中的整个黏膜层(瘤胃背囊和瘤胃腹囊的结果一致)，瘤胃、网胃和瓣胃均为无腺部，在黏膜上皮基底层阳性表达最强；皱胃为有腺部，主要分布在黏膜层，在黏膜上皮阳性表达最强，在固有层胃底腺体中的分布呈由底部到颈部呈逐渐增多的趋势。

2.4 绵羊不同胃室组织中褪黑素膜受体蛋白的表达

由图4可知，在绵羊不同胃室组织中均检测到MT1和MT2蛋白的表达，且MT1和MT2在网胃中的表达量显著高于瘤胃背囊、瘤胃腹囊和皱胃(P<0.05)。MT1蛋白在瓣胃中的表达量显著高于瘤胃背囊和皱胃(P<0.05)，MT2蛋白在在瓣胃中的表达量显著高于瘤胃腹囊和皱胃(P<0.05)。

箭头表示蛋白呈阳性表达Arrows indicate positive expression of the protein图3 绵羊不同胃室组织中MT1和MT2蛋白的免疫组化检测结果(400×)Fig.3 Immunohistochemistry detection result of MT1 and MT2 in different stomachs of sheep (400×)

1～5，分别为瘤胃背囊、瘤胃腹囊、网胃、瓣胃和皱胃1-5，Saccus ruminis dorslis, saccus ruminis ventralis, reticulum, omasum and abomasum, respectively图4 绵羊不同胃室组织中MT1和MT2蛋白的表达量Fig.4 Expression of MT1 and MT2 proteins in different stomachs of sheep

3 讨 论

本试验通过ELISA分析发现绵羊不同胃室组织中褪黑素含量差异较大，其中在皱胃组织中褪黑素含量最高，在瘤胃背囊、瘤胃腹囊和网胃中含量较低。Bubenik等[12-13]在奶牛和猪胃肠道组织中也检测到褪黑素，且还发现褪黑素在奶牛的消化道前段含量较高，而猪的消化道后端含量较高。这些差异可能是由于不同动物的饮食习惯和胃室结构差异所致。此外，基于前期在绵羊胃组织中褪黑素关键合成酶5-羟色胺-N-2酰基转移酶(AANAT)和羟基吲哚-氧-甲基转移酶(HIOMT)的表达分析发现，AANAT和HIOMT表达量的变化趋势与本试验检测到的褪黑素表达模式趋同[11]。这提示，绵羊各胃室至少能以自分泌的方式合成并释放褪黑素。

褪黑素可通过抗氧化[14]、抗凋亡[14]、控制胃黏膜血流量[15]及防止胃缺血再灌注损伤[16]等方式保护胃黏膜，褪黑素对胃黏膜的保护和调控机制可能是通过与受体耦联结合后发挥作用。本研究发现，褪黑素受体MT1和MT2主要分布于黏膜层，表明各胃的黏膜层均存在褪黑素作用靶点。研究显示，黏液-碳酸氢盐屏障是保护胃免受过量胃盐酸侵袭的主要结构[17]，而褪黑素可通过迷走神经和交感神经介导刺激胃黏膜层分泌碳酸氢盐达到保护胃黏膜的作用[18]。结合本试验结果推测，褪黑素可能主要是通过结合受体MT1和MT2介导参与分泌碳酸氢盐的生理过程。此外，本研究还发现MT1和MT2蛋白在固有层呈现从底部到颈部阳性表达逐渐增强的现象。Taslidere等[19]研究显示，在胃黏膜层中存在pH梯度，从胃腔到胃壁pH逐渐递增，胃黏膜中H+主要通过HCO3-中和，因此胃黏膜中HCO3-分泌由底部到颈部也是逐渐增多的阶梯式分布，这提示在绵羊皱胃壁褪黑素可能具有刺激黏膜层分泌碳酸氢盐中和胃酸保护自身的作用。此外，褪黑素还可通过调节上皮细胞通透性防止有害物质渗透以及促进黏膜上皮细胞的生长方式保护胃黏膜[20]。褪黑素受体MT1和MT2在黏膜上的强阳性表达特点与碳酸氢盐分泌趋势一致，进一步验证了褪黑素主要通过MT1和MT2对碳酸氢盐分泌发挥调节作用。

作为多胃室动物，绵羊各胃室功能差异很大。本试验检测到绵羊各胃中褪黑素受体MT1和MT2基因和蛋白的表达存在差异，MT1和MT2蛋白在网胃中表达量最高，在皱胃中表达量最低，而MT1和MT2基因在皱胃中的表达量最高，在瘤胃背囊和网胃的表达量最低，这种差异表达可能是在转录翻译空间上存在差异[21]，或与褪黑素在不同胃室组织功能发挥作用的对应受体不同有关。Katarina等[22]研究发现，在小鼠胃肠道中，MT1蛋白在十二指肠高表达，而MT2蛋白则主要分布于结肠。结合本试验结果，提示褪黑素对绵羊各胃的调控存在较大差异。Western blotting检测发现MT1和MT2在网胃的表达量最大，可能通过膜受体介导的功能部位主要在网胃。绵羊前胃黏膜层无腺体，不能分泌胃液，主要通过微生物消化和前胃的运动进行机械研磨的消化。而皱胃黏膜层有腺体，主要依赖黏膜层分泌胃液进行消化，本试验结果发现MT1和MT2蛋白在前胃中的表达量均高于皱胃，表明褪黑素受体MT1和MT2可能主要介导参与褪黑素对胃动力的调控。在前胃的运动过程中，始发于胃内容物刺激网胃发生双向收缩，网胃将食糜压向瘤胃。此外，当食物刺激口腔感受器，或食糜的性状刺激网胃感受器均可引起动物机体发生逆呕和反刍[17]。推测网胃与瘤胃的协同作用共同促进食糜的往复，佐证了受体在这两部分表达量相似的试验结果，而MT1和MT2在绵羊网胃中的高表达规律说明褪黑素通过MT1和MT2介导对胃肠运动的调控可能在前胃胃动力调节中起重要作用，其确切的调节作用机制需进一步研究。

4 结 论

褪黑素在绵羊各胃组织中差异化表达从而发挥多样性生理功能，其还可能通过与胃组织上特异性受体MT1和MT2结合，通过信号传导系统而调控前胃受食糜刺激后发生反刍生理过程。本研究结果为阐明褪黑素参与绵羊消化系统的调控机制奠定了理论基础。