替米考星原粉和可溶性粉在单次给药肉鸡的药代动力学研究

宋圣哲， 王俊豪， 童照寒， 黄心河， 杨彩梅， 金庆日

(浙江农林大学 动物科技学院·动物医学院 浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室，浙江 临安 311300)

替米考星(Tilmicosin)是美国礼来公司于上世纪80年代开发，并于90年代商品化上市的一种由泰乐菌素半合成的大环内酯类畜禽专用抗生素[1]。替米考星是由泰乐菌素经过酸溶液水解的产物。替米考星的合成路线主要有2条。1) 由泰乐菌素碱进行水解合成；2) 利用泰乐菌素磷酸盐或泰乐菌素酒石酸盐进行水解，脱掉相应的盐基，再进一步合成[2]。替米考星的抗菌谱很广，对所有的革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌、螺旋体、支原体等均有抑制活性。对家禽、猪、牛、羊等动物由敏感菌引起的感染性疾病具有显著的防治效果[3-4]，农业部也已审批多种替米考星原料和制剂[5]。

替米考星的抑菌和杀菌作用机制为抑制细菌蛋白的合成，进而发挥良好的杀菌作用[6]。它可以可逆性的结合细菌核糖体的50S亚单位，作用于P位结合点，阻碍mRNA的移位，阻止肽链的延长[7]，发挥其抑菌活性。但替米考星不与哺乳动物的核糖体80S亚单位结合，此机制可能与其毒性较小有关。据Nerland EM等报道，仔猪感染胸膜肺炎放线杆菌后给其灌服400 μg/g替米考星，可诱导支气管肺泡液中的白细胞凋亡，并减轻肺部炎症[8]。

替米考星的药动学特征表现在通过皮下注射或口服给药后吸收快、血中药物半衰期长、药物组织穿透力强、体内分布容积大[3]、在乳房组织和肺部组织中药物质量浓度高、有效血药质量浓度维持时间长和消除缓慢[9]。替米考星可用于治疗和控制肉鸡的由鸡毒支原体[10]、鼻气管炎鸟疫杆菌[11]、鸡滑液霉形体[12]和多杀性巴氏杆菌及其他敏感菌引起的家禽呼吸道疾病，且效果显著。替米考星对所有的革兰阳性菌、部分革兰阴性菌、支原体及螺旋体均具有良好的抗菌活性[13]。特别对畜禽支原体，化脓棒状杆菌，肺炎链球菌，化脓链球菌，巴氏杆菌，金黄色葡萄球菌及胸膜肺炎放线杆菌的活性比泰乐菌素更强[2]。Jordan F T等的研究结果表明，替米考星和泰乐菌素对鸡滑液霉形体的MIC90分别为0.006～0.025 μg/mL和0.833 μg/mL，替米考星和泰乐菌素对鸡败血霉形体的MIC90为0.002 5～0.1和0.078 μg/mL[10]，由此可知替米考星的抗菌活性较泰乐菌素强。与泰乐菌素相比，替米考星治疗大肠杆菌[14]、鸡毒支原体[10, 14]、鸡巴氏杆菌病[15]感染的病鸡，可降低气囊的损伤程度[14]，减轻病原菌性疾病对实验鸡体重减轻的影响[10]，减少病原菌引起的家禽病理性损害程度，降低死亡率[15]。

该试验将施行替米考星原粉组和37.5%替米考星可溶性粉组的药动学试验，用超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC-MS/MS)检测肉鸡血浆中替米考星的质量浓度，再通过Winnonlin软件，计算药动学参数，阐明替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉在肉鸡体内的吸收、分布、代谢和排泄过程。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1) 仪器 电子分析天平(G&G electronic scale DT5000，上海锡为科学仪器有限公司)；高速离心机(Eppendorf centrifuge 5418，广州雷得生物技术有限公司)；磁力搅拌器(85-2，杭州仪表电机有限公司)；UPLC-MS/MS(美国沃特世公司)；Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 色谱柱(美国沃特世公司)； 振荡混匀器(Vortexgenie2，妙生科技有限公司)；真空浓缩仪(德国艾本德公司)；超声波清洗器(Biosafer SB-5200DT，南京赛飞生物科技有限公司)。

2) 实验动物 健康、体重相似的黄羽肉鸡8只，购自浙江省杭州市临安区肉鸡养殖有限公司。

3) 试剂 替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉，由浙江万方生物科技有限公司提供。肝素钠(185 USP units/mg)、生理盐水、乙腈、甲酸、甲醇，购自生工生物工程(上海)股份有限公司。舒泰50，购自法国维克公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

1) 流动相的制备 0.1%甲酸(A)∶乙腈(B)= 1∶9(V/V)

2) 替米考星标准溶液的制备 准确称取替米考星100 mg，置于5 mL容量瓶，用流动相稀释至刻度，配制质量浓度为20 mg/mL的标准品储备液。用流动相进行梯度稀释，获得质量浓度为0.5、1、2.5、5、10、20、50和200 μg/mL的标准品溶液。

1.2.2 灌服给药

健康肉鸡8只，在温度和湿度恒定的实验动物房(浙江农林大学动物科技学院)适应饲养 1周后，随机分为替米考星原粉组和37.5%替米考星可溶性粉组。灌服给药前禁食12 h以上，不禁水。以30 mg/kg剂量，给其中4只灌服替米考星原粉溶液，另外4只灌服37.5%替米考星可溶性粉溶液。鸡只的体重为(1.87±0.07) kg。

1.2.3 给药和采血方案

替米考星原粉组和37.5%替米考星可溶性粉组以30 mg/kg剂量灌服。分别在肉鸡灌服给药后0.5、1、2、3.5、4、4.5、6、8和24 h，通过翅静脉采集血液，每次采集0.5 mL。将采集好的全血置于肝素纳离心管中，以8 000 r/min 离心3 min，取血浆并保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4 标准曲线样品的预处理与检测

取45 μL鸡空白血浆，置于1.5 mL离心管中，每管加5 μL质量浓度分别为 0.5、1、2.5、5、10 μg/mL替米考星标准溶液，涡旋振荡混匀。每管加150 μL甲醇，涡旋震荡混匀5 min，13 000 r/min离心 5 min，取上清至干净EP管。45 ℃真空干燥，加200 μL流动相，涡旋振荡混匀3 min，13 000 r/min离心5 min，取上清，用UPLC/MS/MS检测血浆中替米考星的质量浓度。

1.2.5 血液样品预处理与检测

取50 μL鸡只血浆，置于1.5 mL离心管中，每管加150 μL甲醇，涡旋震荡混匀5 min，13 000 r/min离心5 min，取上清至干净EP管。45 ℃真空干燥，加200 μL流动相，涡旋振荡混匀3 min。13 000 r/min离心5 min，取上清，用UPLC-MS/MS检测血浆中替米考星的质量浓度。

1.2.6 液相色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18 Column(2.1×100 mm，1.7 μm)，流动相为0.1%甲酸(A)：乙腈(B)= 1∶9(V/V)。梯度洗脱条件如下，0～1 min为90% A，1～2 min为5% A，2～3 min为 50% A，3～5 min为90% A。流速为0.3 mL/min，进样体积为10 μL，分析时长为5 min。

1.2.7 质谱分析条件

用电喷雾离子源(ESI)，正离子(ES+)模式进行扫描，多离子反应监测(MRM)模式下进行检测。替米考星母离子的质荷比(m/z)为869，二级质谱子离子的质荷比为174，相应的碰撞电压分别为58 eV和51 eV。其他参数的设置如下：脱溶剂温度500 ℃，脱溶剂气流量800 L/hr，锥孔电压25 V，锥孔气流量50 L/hr，毛细管电压3.50 kV。

1.2.8 数据分析

用 Winnonlin 软件的非房室模型，计算各种药动学参数，如消除半衰期(t1/2)、峰时(Tmax)、峰浓度(Cmax)、药-时曲线下面积(AUC)、表观分布容积(Vz)、体清除率(CL)和平均滞留时间(MRTlast)等。

2 结果与分析

2.1 质谱分析

在正离子模式下，替米考星母离子经能量碰撞，碎裂成特征性子离子。质荷比为869的替米考星母离子碎裂成质荷比为174的子离子。

2.2 替米考星血浆样品的标准曲线

替米考星标准溶液的质量浓度依次为0.05、0.1、0.25、0.5、1 μg/mL。以替米考星标准溶液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。在质量浓度为0.05 ～ 1 μg/mL时，替米考星峰面积与标准溶液质量浓度呈线性相关，标准曲线见图1，按照标准溶液质量浓度和峰面积得到回归方程为y=3.852 5 x+113.46，相关系数(R2)为0.996。

图1 替米考星的标准曲线

图2a为肉鸡空白血浆色谱图。如图2a所示，肉鸡空白血浆中未检测出明显的杂质峰，此分析方法可应用于替米考星肉鸡血浆样品的分析。图2b为替米考星标准溶液(0.25 μg/mL)的色谱图，图2c为肉鸡灌服替米考星原粉后1 h的色谱图。替米考星的保留时间为2.60 min，峰型对称，分离度好，无杂质峰干扰。

a为肉鸡空白血浆的色谱图；b为替米考星标准溶液(0.25 μg/mL)的色谱图；c为肉鸡灌服替米考星原粉后1 h的色谱图

2.3 肉鸡灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉溶液后的血药浓度

表1 灌服盐酸替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉后的血药质量浓度

图3为肉鸡灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉溶液后的药时曲线。由表1和图3可知，除了给药后8～24 h以外，肉鸡灌服37.5%替米考星可溶性粉溶液后的血药质量浓度均高于替米考星原粉的血药质量浓度。其中，肉鸡灌服37.5%替米考星可溶性粉溶液后3.5 h的血药质量浓度显著高于替米考星原粉(表1)。如表2和图3所示，37.5%替米考星可溶性粉溶液后的AUCall和AUCinf均大于替米考星原粉的AUCall和AUCinf，表明37.5%替米考星可溶性粉在肉鸡体内到达全身血液循环的量大于替米考星原粉。

图3 肉鸡灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉后的药时曲线

2.4 药动学参数的计算

用Winnonlin软件的非房室模型，计算各种药动学参数，表2为肉鸡灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉后的药动学参数。

表2 灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉后的药动学参数

由表2可知，AUCall指t0～t10 h的药时曲线下面积，AUCinf指t0～t∞的药时曲线下面积，MRTlast为平均滞留时间。

肉鸡灌服37.5%替米考星可溶性粉后的Cmax大于替米考星原粉，AUCall和AUCinf也均大于替米考星原粉的AUCall和AUCinf。肉鸡灌服37.5%替米考星可溶性粉和替米考星原粉后的t1/2无显著性差异。肉鸡灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉后的Vz、CL和MRTlast均小于替米考星原粉，表明37.5%替米考星可溶性粉在体内的分布和滞留时间短于替米考星原粉，因此,用37.5%替米考星可溶性粉时可缩短其休药期。

3 讨论与结论

以30 mg/kg灌服替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉后的Tmax均出现在2 h。但是Tmax是时间依赖性参数，只有当药物的释放速度与临床疗效或安全性密切相关时，才需要做统计和评价。肉鸡灌服37.5%替米考星可溶性粉后的Cmax显著大于替米考星原粉，AUCall和AUCinf也均大于替米考星原粉的AUCall和AUCinf，表明37.5%替米考星可溶性粉在肉鸡体内的吸收速率、吸收程度和到达全身血液循环的量均大于替米考星原粉，由此也可以推测37.5%替米考星可溶性粉在肉鸡体内的生物利用度也高于替米考星原粉。通过该试验获得的37.5%替米考星可溶性粉的相对生物利用度为266.7%。

用高效液相色谱法(HPLC)检测鸡血浆中替米考星质量浓度时，大多数血浆样品中替米考星的质量浓度低于在检测限，无法准确无误地检测鸡血浆中替米考星的质量浓度。因此，该试验选用UPLC-MS/MS，检测鸡血浆中替米考星的质量浓度。UPLC-MS/MS技术近10年来发展迅速并逐渐成熟，在检测分析领域应用广泛。液质联用技术既具有液相色谱的高分离能力，也具有质谱的强特异性、多通道检测、高灵敏度等特点[16]。它对生物样本的预处理要求较低，样品中不同组分不需要完全分离，对样品中微量组分可进行定性和定量分析，分析过程极大地被简化，分析时长也较短。

该试验用UPLC-MS/MS检测肉鸡血浆中替米考星的质量浓度，再通过药动学研究阐明替米考星原粉和37.5%替米考星可溶性粉在肉鸡体内的药动学行为。试验结果表明，37.5%替米考星可溶性粉比替米考星原粉具有更好的吸收程度和更短的滞留时间，临床应用可适当减少给药剂量或增加给药间隔时间，也可缩短休药期。37.5%替米考星可溶性粉可提高替米考星的相对生物利用度，防止抗生素的滥用，合理应用抗生素，避免细菌耐药性的产生。该试验的研究结果将为37.5%替米考星可溶性粉的临床应用提供理论和应用依据，也将为大环内酯类药物的药动学研究提供参考。