微量稀释法和琼脂稀释法测定淋球菌药物敏感性的比较

梁佩婵 吴志周 林仲女

（江门市皮肤医院检验科 广东江门 529000）

目前淋球菌的药物敏感性检测方法包括K-B纸片扩散法、E-test 法、琼脂稀释法（AD）。纸片法操作简单，但是该法不能测定受试菌的最低抑菌浓度（MIC）值。E-test 法虽可直接测定MIC 值，但试纸条较昂贵。琼脂稀释法是WHO 推荐的方法，但该方法操作繁琐，难以广泛开展。实验室如何为临床提供快速、准确的淋球菌药敏MIC 报告，并能在实验室常规开展值得关注。有研究人员通过改良微量稀释法（MD）[1]应用于淋球菌的药物敏感性试验。这种方法与琼脂稀释法一致性如何，是值得关注的问题。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

临床菌株：淋球菌菌株自2020 年1 月至2021年12 月从我院性病门诊淋病患者的泌尿生殖道中分离得到。菌株根据其菌落形态，显微镜下菌体形态，氧化酶试验及糖发酵试验确证，分纯后置于在小牛血清中保存-70℃冰箱保存备用。

参考菌株：参考株G、J、K、L、P 和ATCC49226由广东省皮肤性病防治中心提供。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 仪器。比浊仪、CO2培养箱、电子分析天平、-70℃超低温冰箱。

1.2.2 抗生素。青霉素、四环素、环丙沙星、大观霉素、头孢曲松、头孢克肟、阿奇霉素由广东省皮肤性病防治中心提供。

1.2.3 培养基。微量稀释法试剂盒、GC 基础培养基、淋球菌选择培养基。

1.3 方法

1.3.1 微量稀释法：按照试剂盒的说明书操作。药敏板是预先制成含青霉素、四环素、环丙沙星、大观霉素、头孢曲松、头孢克肟和阿奇霉素等12 个浓度梯度的96 孔板。检测浓度：青霉素、四环素和环丙沙星均为0.015 微克/毫升～32 微克/毫升，大观霉素0.06 微克/毫升～128 微克/毫升，头孢曲松和头孢克肟为0.005 微克/毫升～1 微克/毫升，阿奇霉素0.004 微克/毫升～8 微克/毫升。淋球菌用无菌生理盐水配制成0.5MFC 菌悬液，吸取150 微升菌悬液加于MH 肉汤培养基中混匀，将混匀液分别加到96 孔药敏板内（每孔100 微升），放于35℃、5%～10%CO2培养箱孵育24 小时后读取结果。

1.3.2 琼脂稀释法：作为参考方法，按WHO 推荐的方法[2]制备抗生素琼脂平板。7 种药物的最终浓度和微量稀释法相同。淋球菌用无菌生理盐水配制成0.5MFC 菌悬液，取2 微升点样接种于抗生素琼脂平板中。接种完毕后各平板放入35℃、5%～10%CO2培养箱孵育24 小时后观察结果。

1.3.3 每批实验均有参考菌株作质量控制并设立阴性和阳性对照。结果判读标准参考WHO 西太区淋球菌耐药监测规划推荐标准[3]。

1.4 两种方法一致性评价标准

采用分类一致性（CA）、基本一致性（EA）、重大误差（ME）、极重大误差（VME）、微小误差（MIE）对两种方法进行比较。CA 为两种方法药敏结果的一致性。EA 为两种方法测定的MIC 值相差不超过1 个稀释倍数。ME 是指AD 判为S 时，MD 判为R。VME 是指AD 判为R 时，MD 判为S。MIE 指AD或MD 判为I 时，另一种方法判为S 或R。当CA 或EA≥90%，VME 或ME≤3%，MIE≤7%为可接受的结果。

1.5 统计学处理

分别计算两种方法所得的耐药率，用卡方检验比较耐药率是否有差异，P＜0.05 表示差别有统计学意义。

2 结果

2.1 质控结果

两种方法检测参考菌株的MIC 值均在参考范围内，差异不超过±1。

2.2 两种方法的比较

两种方法测定的药敏结果，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。对环丙沙星、大观霉素、头孢曲松、头孢克肟、阿奇霉素一致性较好，对青霉素一致性稍差。见表2。

表1 两种方法测定的药敏结果

表2 两种方法测定结果的一致性（%）

3 讨论

由于滥用或不恰当应用抗生素治疗，淋球菌耐药形势日趋严重[4]，淋球菌的耐药性已成为全球的公共问题[5]，再不控制将面临无药可治的局面[6]。因此对淋球菌实施耐药监测非常重要。淋球菌耐药性检测的方法主要有纸片扩散法、琼脂稀释法、E-test法。纸片扩散法操作简单，在评价药物敏感性方面只能定性不能定量。琼脂稀释法定量检测抗菌药物对被测菌的MIC，可同时检测多种细菌对一种药物的耐药性，是WHO 推荐的参考方法。但是该方法操作繁琐，不适合实验室的常规开展，只能作为回顾性监测。E-test 法结合了琼脂稀释法和纸片扩散法原理，重复性好，但E-test 法受到专利保护，试条成本较高，对临床批量标本使用较为困难。

淋球菌的生长需要适当的温度和二氧化碳浓度，在液体培养基中生长较差。微量稀释法可以对一株菌同时进行多种药物的敏感性测定，是用于检测细菌MIC 快速和简便的方法，淋球菌除外。有研究人员尝试开发适用淋球菌的微量稀释法，但大多数准确性低。WU 等人改良的微量稀释法，淋球菌形成的菌落悬浮容易观察，操作简单，结果判读容易，无需特殊仪器。本次研究表明，微量稀释法与琼脂稀释法测定淋球菌对7 种抗生素的敏感性、耐药率没有统计学差异。对环丙沙星、大观霉素、头孢曲松、头孢克肟、阿奇霉素敏感性检测的一致性较好。但青霉素CA89.9%、MIE10.1%、四环素VME3.4%不在可接受范围内。青霉素和四环素的误差是由于一些菌株的MIC 分布引起的。

这些分离株的MIC 值比WHO 推荐的标准判断高于或低于一个稀释度，一个稀释度的偏差可能引起不同的敏感性判别。如果在原液制备过程中，不溶性抗生素不能被溶剂完全溶解，然后将低浓度梯度药物溶液冻干制作微孔板，微量稀释法检测的MIC 值就高于琼脂稀释法。微量稀释法是用于淋球菌抗菌药物敏感试验的有效方法[7]，能及时发现耐药菌株（头孢曲松或阿奇霉素），有助于淋球菌感染的个体化治疗，有效控制淋病的流行。

综上所述，微量稀释法和琼脂稀释法对淋球菌抗菌药物敏感试验有较好的一致性，可为临床提供快速、准确的淋球菌药敏MIC 报告，能在实验室常规开展。