模拟酸雨对三叶草种子萌发和幼苗生长的影响

岳雪娇， 刘 英， 向仰州， 黄 沛， 姚 斌

(1.中国林业科学研究院荒漠化研究所， 北京 100091；2.中国林业科学研究院生态保护与恢复研究所， 北京 100091；3.贵州师范学院生物科学学院， 贵阳 550018； 4.贵州师范学院地理与资源学院， 贵阳 550018)

TrrifoliumrepensL.

酸雨是当前影响和破坏生态系统的世界性重大环境问题之一[1-2]。近年来，我国酸雨有加重和蔓延的趋势，2020年我国能源总需求量为23.2亿～31.0亿吨标准煤(其中90%的能源是化石燃料)，致酸物质(如二氧化硫、氮氧化物)的排放量大幅增加[2]。现阶段我国受酸雨影响的地区已占国土面积的30%，酸雨给我国的经济建设和人民生活造成了很大损失，已成为制约我国经济和社会可持续发展的一个重要环境因素。

在土壤日益酸化的背景下，酸雨加快了土壤盐基离子流失，导致酸化程度不断加剧，不同程度影响植物的生长发育。酸雨胁迫能不同程度改变植物细胞质膜的透性，导致细胞功能丧失，表现为植物叶片不能正常进行光合作用，根系对土壤营养物质的吸收存在障碍。已开展的酸雨胁迫对植物生长发育响应特征及机理研究[3-6]的目标作物主要是粮食作物(如水稻[3,5,7]、小麦[3,5])、经济作物(如油菜[3,5]、白菜[9]、板蓝根[1]、棉花[11])、饲料作物(紫花苜蓿[8]、小黑麦[4])等，对草本植物的研究相对较少。白三叶和红三叶是豆科三叶草属多年生草本植物，兼具色泽美、绿期长、修剪次数少及固氮能力强等特性，为优良的牧草，同时在草坪建植中被广泛使用。酸雨对优质牧草和重要草坪建植种三叶草的影响将逐步引起研究者的重视。但目前关于模拟三叶草逆境胁迫的研究多集中于干旱胁迫[12-13]、盐胁迫[14-15]及重金属胁迫[16-17]，酸雨胁迫对三叶草生长发育的研究报道甚少。鉴于此，通过研究不同pH的酸雨胁迫条件下白三叶和红三叶的种子萌发及幼苗生长特征，量化判别二者对酸雨抵抗能力的强弱及差异，以期为酸雨或土壤酸化严重地区选种及其管理提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料白三叶购自贵州克劳沃草业有限公司，品种为海法白三叶(TrifoliumrepensL.cv.Haifa)；红三叶由贵州绿地生态科技有限公司提供，品种为岷山红三叶(Trifoliumpretense‘Minshan’)。

1.2 试验设计

分别对白三叶和红三叶进行不同的模拟酸雨胁迫处理，以去离子水为对照，共12个处理，5次重复。模拟酸雨的制备参照文献[18]配制：先用硫酸和硝酸制备pH=1.0的酸雨母液，其中硫酸根和硝酸根的体积比为4.7∶1。以去离子水为稀释液，将母液分别调制成pH值为 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0的酸雨，并经ZD-型自动电位滴定仪校准(上海雷磁仪器公司)后备用。

分别选取籽粒饱满，粒径大小相近的白三叶和红三叶种子用于试验，先用0.05%的高锰酸钾溶液消毒30 min，去离子水漂洗3次，然后用吸水纸吸干种子表面的水分得到备用草种。根据国际种子检验规程[19]，采用双层滤纸发芽。在预先进行标记的培养皿中铺2层滤纸，选取预处理后的白三叶和红三叶种子放在滤纸上，50粒/皿，种子间距尽量保持一致。然后用移液管分别准确量取pH值为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0的模拟酸雨溶液加入培养皿中，因滤纸干燥，第一次酸雨用量12 mL，以后每次用量10 mL。为保证酸雨浓度不变，每2 d更换一次相应的酸液。将各处理培养皿移至GXZ型光照培养箱(宁波江南仪器厂)进行培养，温度(25±0.5)℃，光照时间12 h/d。以后每天打开2次，与外界换气5 min。发芽以突破种皮的胚轴长度达到真种子自身的长度为标准，每天统计发芽的种子数。

1.3 种子萌发的观测与评估

发芽势(%)=(4 d内正常发芽粒数/供试种子数)×100%[20]；

发芽率(%)=(8 d内全部正常发芽粒数/供试种子数)×100%[21]；

用电子天平称量2个品种幼苗鲜重；

将2个品种幼苗放置在80 ℃的恒温箱中，24 h后取出用电子天平直接称重；

发芽指数=∑(Gt/Dt)，式中，Gt为总的发芽粒数，Dt为相应的发芽天数[22]；

活力指数=GI×S，式中，GI为发芽指数，S为第8天单株幼苗平均鲜重[1]。

1.4 数据处理

采用DPS 14.5统计软件对数据进行方差分析[16]，并用Duncan’s 法进行处理间的多重比较，利用sigmaplot 12.5 软件作图。

2 结果与分析

2.1 酸雨胁迫对红三叶和白三叶种子发芽的影响

植物受到逆境胁迫会导致植物生长发育受到抑制，植物种子耐受环境因素胁迫的表现各异。模拟酸雨对2种三叶草种子发芽势的影响见图1。由图1可知，随着酸雨pH值的降低，红三叶与白三叶种子的发芽势均呈减小趋势，且其发芽势均低于对照。酸雨pH值5.0处理红三叶与白三叶种子的发芽势均与对照差异不显著，受酸雨胁迫影响不明显。红三叶品种除pH值5.0处理外，其余处理的种子发芽势均与对照差异极显著(p<0.01)，但处理间无显著性差异。酸雨pH值2.0和pH值2.5处理白三叶的种子发芽势与对照差异极显著(p<0.01)，pH值3.0处理与对照差异显著(p<0.05)。

模拟酸雨对2种三叶草种子发芽率的影响见图2。由图2可知，随着酸雨pH值的降低，红三叶与白三叶种子发芽率均呈减小趋势。但与对照相比，红三叶与白三叶种子发芽率在pH值为5.0酸雨处理下略有增加，而其余处理的种子发芽率均低于对照。红三叶品种在pH值为5.0时受酸雨胁迫的影响不明显，其余处理的种子发芽率均与对照呈差异极显著(p<0.01)，且pH值为3.0、2.5、2.0处理较pH值为4.0、3.5处理差异极显著(p<0.01)。pH值为5.0和pH值为4.0处理白三叶受酸雨胁迫的影响不明显，其余处理的种子发芽率均与对照差异极显著(p<0.01)，且pH值为2.5和pH值为2.0的酸雨处理与pH值为3.5处理呈差异极显著(p<0.01)。

图1 模拟酸雨对红三叶和白三叶种子发芽势的影响Fig.1 The effect of simulated acid rain on the seed germination potential of red and white clover

图2 模拟酸雨对红三叶和白三叶种子发芽率的影响Fig.2 The effect of simulated acid rain on the seed germination rate of red and white clover

2.2 酸雨胁迫对红三叶和白三叶种子活力的影响

一般而言，发芽率能反映环境胁迫对种子萌发的影响，但要反映出种子的活力及出苗的整齐程度则很难，通常以种子发芽指数来表征种子的活力。模拟酸雨对2种三叶草种子发芽指数的影响见图3。由图3可知，随着酸雨胁迫强度增加，红三叶与白三叶种子发芽指数均呈减小趋势。红三叶种子发芽指数均低于对照，且仅pH值为2.0和pH值为3.0处理与对照差异极显著(p<0.01)，pH值为2.5处理与对照差异显著(p<0.05)，其余处理种子发芽指数均与对照差异不显著。白三叶除pH值为5.0处理外，其余处理的种子发芽指数均与对照差异极显著(p<0.01)，且处理间均差异极显著(p<0.01)。

图3 模拟酸雨对红三叶和白三叶种子发芽指数的影响Fig.3 The effect of simulated acid rain on the seed germination index of red and white clover

模拟酸雨对2种三叶草种子活力指数的影响见图4。由图4可知，随着酸雨胁迫强度增加，红三叶种子活力指数无明显变化趋势，而白三叶种子活力指数呈现明显减小趋势。相较于红三叶，白三叶种子活力指数受到酸雨胁迫的影响更明显。红三叶除pH值为2.0处理与对照差异显著外(p<0.05)，其余处理的种子活力指数均与对照差异不显著。白三叶种子活力指数均低于对照，且pH值为5.0处理的种子活力指数与对照无显著性差异，受酸雨胁迫影响不明显；其余处理下的种子活力指数均与对照差异极显著(p<0.01)，但处理间均无显著性差异。

2.3 酸雨胁迫对红三叶和白三叶幼苗重量的影响

酸雨胁迫会对植物的生物量产生影响，模拟酸雨对2种三叶草幼苗鲜重的影响见图5。由图5可知，随着酸雨胁迫强度增加，红三叶与白三叶幼苗鲜重均呈现降低趋势，且两个品种的幼苗鲜重均低于对照。相较于红三叶，白三叶幼苗鲜重受酸雨胁迫的影响更明显。pH值为5.0处理的红三叶幼苗鲜重与对照无显著差异，受酸雨胁迫影响不明显；其余处理的幼苗鲜重均与对照差异极显著(p<0.01)，但处理间均无显著性差异。白三叶仅pH值为2.0和pH值为2.5处理与对照差异极显著(p<0.01)，而pH值为3.5处理与对照差异显著(p<0.05)，其余处理的幼苗鲜重均与对照差异不显著。

图4 模拟酸雨对红三叶和白三叶种子活力指数的影响Fig.4 The effect of simulated acid rain on the seed vigor index of red and white clover

图5 模拟酸雨对红三叶和白三叶幼苗鲜重的影响Fig.5 The effect of simulated acid rain on the fresh biomass of red and white clover seedlings

图6 模拟酸雨对红三叶和白三叶幼苗干重的影响Fig.6 The effect of simulated acid rain on the dry biomass of red and white clover seedlings

模拟酸雨对两种三叶草幼苗干重的影响见图6。由图6可知，随着酸雨pH值的降低，红三叶与白三叶幼苗干重均呈缓慢降低趋势。pH值为5.0酸雨处理红三叶的幼苗干重与对照差异显著(p<0.05)，其余处理均与对照差异极显著(p<0.01)。白三叶幼苗干重虽均低于对照，但酸雨pH值为3.5、4.0、5.0处理幼苗干重均与对照差异不显著，仅酸雨pH值为2.0、2.5、3.0处理与对照差异极显著(p<0.01)。

3 讨 论

酸雨不仅对动植物具有直接的伤害作用，还会影响土壤肥力和活性，对作物生长造成损害，具有严重的危害性[23-24]。种子萌发和成苗这两个关键阶段决定了植物是否能够正常生长。

3.1 酸雨胁迫对三叶草种子萌发的影响

种子萌发期是植物生长周期中极易受到环境因素影响的关键时期之一，对外界环境十分敏感[25]。种子的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数等指标可以用来反映种子的萌发能力，表征植物抗逆性的强弱[26]。本研究中，红三叶种子pH值为5.0酸雨处理的发芽势、发芽率、发芽指数及活力指数与对照差异不显著，表明适当pH的酸雨对红三叶种子萌发无明显抑制作用，这与王文彦[27]的研究结果一致。pH值为4.0、3.5酸雨处理的红三叶种子萌发虽受到酸雨胁迫影响，但影响较小并且均能正常萌发。而在酸雨pH值为3.0、2.5、2.0时，红三叶种子萌发受到酸雨胁迫的影响较大，原因可能是重度酸雨胁迫导致种子细胞内保护酶活性降低，储藏物质分解及呼吸代谢受到抑制，缺少萌发所需物质和能量[28]。但在该处理下仍有部分种子能够正常萌发，种子活力指数甚至与对照无显著性差异，说明红三叶品种的抗酸性能力较强。白三叶品种种子萌发受酸雨胁迫的影响较大，其种子活力在酸雨胁迫下严重下降。酸雨pH值为3.5、3.0、2.5、2.0时，有部分种子可以萌发，这与魏祯祯等[29]对4种草坪草种子进行酸雨pH值为2.0时的模拟酸雨实验，得到的种子萌发均受到完全抑制的结果不同，说明不同种子对酸雨的抵抗力各异。在酸雨pH值为5.0的条件下，白三叶种子能够正常萌发，种子发芽率和发芽指数甚至略高于对照，这与王瑞龙[30]等对三叶鬼针草进行的模拟酸雨实验结果相似，可能的原因是模拟酸雨中含有部分氮氧化物，氮氧化物可以为种子提供氮源，从而有利于种子萌发[31]。

3.2 酸雨胁迫对三叶草幼苗生长的影响

植物对酸胁迫的耐受存在一定的范围。研究表明，景天三七能够适应pH值为4.2～6.2的土壤环境[32]，类芦能够耐受的土壤环境pH值范围为3.5～5.6[33]，而刨花楠在pH值为2.5的土壤环境中仍然能够正常生长[34]，由此可知，不同植物对生长环境的酸胁迫的耐受程度不同，而种子成苗是植物生长周期中决定植物是否能够正常生长的两个关键阶段之一，通过酸雨胁迫对三叶草幼苗生长的影响可以在一定程度上判断其酸雨耐受能力。本研究通过三叶草幼苗的鲜重与干重来评价其生长情况，红三叶幼苗pH值为5.0酸雨处理的鲜重、干重均与对照差异不显著，表明适当pH的酸雨对红三叶幼苗的生长无明显抑制作用。pH值为4.0、3.5酸雨处理的红三叶幼苗生长受酸雨胁迫影响较小，表明红三叶品种可以耐受pH值为4.0、3.5的模拟酸雨，该结果与郝国宝等[35]对夏枯草种子进行的模拟酸雨实验结果相似。而在酸雨pH值为3.0、2.5、2.0时，红三叶幼苗生长受到酸雨胁迫的影响较大。白三叶品种幼苗生长相较于红三叶品种受酸雨胁迫的影响更大，酸雨pH值为3.5、3.0、2.5、2.0时，幼苗的生长量极小，这与汪赛[36]对茶幼苗进行的酸雨处理实验结果相似，表明白三叶品种的抗酸性能力低于红三叶品种。

4 结 论

红三叶与白三叶种子萌发和幼苗生物量均不同程度地受到模拟酸雨胁迫的抑制，但随着酸雨胁迫程度增加，红三叶种子的萌发潜力和幼苗的生物量累积均高于白三叶，说明红三叶对酸雨胁迫的耐受性更强，本研究中其pH耐受范围为2.0～4.5。因此，在酸性土壤或酸雨胁迫环境下，为提高草坪或牧草的产量及质量，需要考虑选育抗酸性能力较强的三叶草品种，即可以选择红三叶作为耐酸品种。

植物在生长过程中会启动一定的防御机制来应对外界的各种胁迫[37]，当前，我国的酸雨问题仍然突出，硫酸型、混合型及硝酸型三种类型的酸雨并存，而且酸雨类型逐渐向硫酸硝酸混合型转变，并且存在向硝酸型酸雨转变的趋势[38]。而上述研究仅为红三叶种子在不同pH混合型酸雨胁迫(硫氮比为4.7∶1)下的初步结果，其潜在的生理生化及基因水平反馈机制仍需要进一步深入探讨，以期为耐受酸雨的红三叶品种选育、建植及管理提供理论依据。