八宝景天对果蝇肠道损伤的缓解作用研究

臧铭圻 ，刘彤宇 ，王思宏 ，金丽华 *

（1.东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.延边大学 分析测试中心，吉林 延吉 133002）

八宝景天Hylotelephium erythrostictum为景天科多年生肉质草本植物[1]，有研究表明，八宝景天具有清热解毒、活血止痛等功效，外用可治疗咽喉肿痛、跌打损伤、疔疮痈肿和高血压等病症，内服可治疗荨麻疹和乳腺炎等病症[2]。

果蝇属于双翅目昆虫，具有体积小、易饲养、繁殖快、后代数目多等优点。果蝇在研究遗传与动物发育等领域已经成为重要的模式生物，在生理、疾病和免疫反应等方面研究中同样具有重要地位[3]。肠道不仅是生物体重要的消化器官，也是最大的免疫器官。果蝇的肠道中存在一种多功能肠道干细胞（intestinal stem cells，ISCs），其具有干细胞的特性。这类细胞可以通过分裂产生新的同类干细胞和肠下皮细胞（enteroblasts，EBs）[4]。肠下皮细胞经过进一步分化过程形成具有分泌功能的肠内分泌细胞（enteroendocrine cells，EEs）和具有营养吸收功能的肠上皮细胞（enterocytes，ECs）[5-6]。果蝇肠道免疫应答反应可以使肠道上皮细胞产生大量的活性氧自由基（ROS）和抗菌肽，从而保护肠道内稳态[3]。正常情况下，果蝇肠道内的ROS 水平较低，但外源物质或致炎因子会刺激EC 细胞导致肠道细胞内ROS 水平升高。同时，EC 细胞可以通过激活肠道的JAK/STAT 等途径诱导肠道干细胞增殖，从而补充受到损伤的肠上皮细胞，并维持肠道稳态[7]。

目前国内外对八宝景天影响肠道干细胞分化及肠道修复的研究较少，大部分研究主要集中在其药理特性和景观应用，如八宝景天对土壤中重金属元素具有吸附积累作用，其乙醇提取物可以清除自由基、具有抗氧化作用等[2]。因此，根据八宝景天具有治疗炎症的特性，可以进一步探究其对肠道炎症的影响[2]。本试验利用致炎因子十二烷基硫酸钠（SDS）诱导果蝇肠道损伤以后，通过喂食八宝景天水提物，分析果蝇生存率、肠道上皮死亡细胞数量、肠道内ROS 水平、肠道前体细胞形态和数量、肠道形态变化等，探究八宝景天水提物对致炎因子引起的果蝇肠道干细胞损伤的修复效果。

1 材料、试剂及主要仪器

1.1 动 物

野生型黑腹果蝇Drosophila melanogaster的w1118品系和esg-Gal4 UAS-GFP品系转基因果蝇为试验室保存。果蝇培养条件为：温度（25±0.5）℃、相对湿度60%～70%。

1.2 试 剂

十二烷基硫酸钠（SDS）购自美国 Amresco 公司，百草枯（paraquat，PQ）购自美国 Sigma 公司，7-氨基放线菌素（7-AAD）、二氢乙啶（DHE）、绿色萤光蛋白（GFP）抗体、rabbit Alexa Fluor488 抗体和Hoechst 购自Thermofisher 公司。中药八宝景天购自哈尔滨市人民同泰药店，由东北林业大学生命科学学院冯富娟教授鉴定为景天科八宝景天。

1.3 仪 器

ALC-210.4 型电子分析天平购自北京赛多利斯公司，Elix5 型去离子水系统购自Millipore 公司，SZ51 型显微镜购自Olympus 公司，Zeiss Scope A1型荧光显微镜购自Zeiss 公司。

2 试验方法

2.1 八宝景天水提物的制备

称取20 g 八宝景天，加入200 mL 去离子水浸泡12 h，用中火熬制3 h，用纱布过滤后收集滤液。在剩余的滤渣中加入200 mL 去离子水，用同样的方法再提取1 次。最后将两次滤液合并，加热浓缩至100 mL，即得到质量浓度为200 mg·mL-1（20%）的八宝景天水提物，用去离子水将其稀释至10%，置于冰箱4 ℃保存备用。

2.2 果蝇培养基的制备

称取25 g 麦芽粉，放入60 ℃的200 mL 去离子水中浸泡20 min 后过滤，即为麦芽粉滤液。依次称取琼脂粉 2.8 g、酵母 8.4 g、黄豆粉 4.9 g、玉米粉35.6 g，再加入300 mL 去离子水，加热至粘稠，边搅拌边加入麦芽粉滤液，煮沸后加入37.5 mL 麦芽糖饴，搅拌均匀后再次煮沸5 min，然后停止加热，冷却至 60 ℃左右，加入 2.5 mL 防腐剂（10% Nipagin），搅拌均匀后倒入果蝇管或果蝇瓶中。

2.3 果蝇生存率的测定

随机收集3 组羽化3～5 d 的w1118品系果蝇，每组30 只，雌雄各半，饥饿处理2 h 后，分别置于不同的果蝇管中诱导培养，每个果蝇管中放入5 张圆形滤纸片，滤纸片分别用 400 μL 5 %蔗糖（SUC）、0.6%SDS 溶液（含5%蔗糖）和加入10%八宝景天水提物的0.6%SDS（含5%蔗糖）溶液浸湿，培养6 d，每24 h 更换1 次滤纸片，记录存活果蝇数量，计算生存率

生存率（%）=每个时间节点果蝇的存活数/试验开始时的总数

为进一步证明八宝景天水提物对其他致炎因子诱导后果蝇生存率影响，分别喂食PQ 和NaCl 后分析果蝇的生存率。6 mmol·L-1PQ 和 0.4 mol·L-1NaCl 环境下的生存率测定方法同上。以上每组试验重复3 次。

2.4 果蝇肠道上皮细胞死亡情况测定

随机收集3 组羽化3～5 d 的w1118品系雌果蝇，每组20 只，挑取处理方法同2.3，诱导培养96 h，每24 h 更换一次滤纸片。在显微镜下于PBS（NaCl 137 mmol·L-1，KCl 2.7 mmol·L-1，Na2HPO44.3 mmol·L-1，KH2PO41.4 mmol·L-1，调节 pH 值为 7.2～7.4）中提取果蝇肠道（置于冰上），然后用7-AAD（1∶200）染色 30 min；用 PBS 清洗 4 次，每次 10 min；4% 多聚甲醛固定30 min；用PBS 清洗4 次，每次10 min；然后用 Hoechst（1∶500）染细胞核 10 min；最后用PBS 清洗3 次，每次5 min；使用70%甘油封片后置于荧光显微镜下观察并拍照记录，试验重复2 次。

2.5 果蝇肠道上皮细胞RROOSS水平的测定

挑取处理果蝇方法同2.3，诱导培养48 h，每24 h 更换一次滤纸片。显微镜下于常温PBS 中提取果蝇肠道，然后用 1 mmol·L-1DHE（1∶200）即5 μmol·L-1DHE 染色 30 min；PBS 清洗 4 次，每次5 min；4%多聚甲醛固定5 min；然后用PBS 冲洗1次后，加入Hoechs（t1∶500）染色5 min；最后用PBS清洗3 次，每次3 min；70%甘油封片后置于荧光显微镜下观察并拍照记录，试验重复2 次。

2.6 果蝇肠道前体细胞形态与数量的测定

esg-Gal4 UAS-GFP品系果蝇自身携带绿色荧光蛋白GFP，且其能够对前体细胞进行特异性标记，根据这一特点对果蝇肠道前体细胞形态和数量进行测定。随机收集3 组羽化3～5 d 的esg-Gal4 UAS-GFP品系雌果蝇，每组20 只。处理诱导方法同2.4，诱导时间为16 h。将分离出的肠道置于4%多聚甲醛中固定30 min；用PBST（PBS+0.1% Triton X-100）清洗 5 次，每次 10 min；使用 PBST+5%goat serum 封闭 30 min，加入一抗 rabbit-GFP（1∶200），4 ℃过夜。第 2 天用 PBST 清洗 5 次；用二抗rabbit Alexa Fluor488（1∶200）结合 2 h；用 PBST 清洗，然后用Hoechst（1∶500）染色10 min；最后再用PBST 清洗 4 次，每次 5 min；70% 甘油封片后置于荧光显微镜下观察并拍照记录，试验重复2 次。

2.7 果蝇肠道形态的测定

挑取处理果蝇及诱导方法同2.3。在显微镜下于常温PBS 溶液中提取果蝇肠道，并使用70% 甘油封片后，置于自然光显微镜下观察并拍照记录，试验重复2 次。

2.8 数据统计与分析

使用ImageJ 软件进行肠道长度、细胞数量、相对荧光强度等指标的测量统计，采用Prism 6 软件进行统计学分析，组间差异采用单因素方差分析。

3 结果与分析

3.1 八宝景天水提物对致炎因子诱导后果蝇生存率的影响

随机收集w1118品系果蝇经过喂食SDS 诱导肠道损伤6 d 后，生存率为11.11%，但添加了10% 八宝景天水提物的生存率为100%，与喂食SDS 组相比，果蝇生存率增加了88.89%，没有出现死亡，两组具有极显著差异（P＜0.000 1）（图 1 A）。

图1 八宝景天对喂食SDS、PQ、NaCl果蝇生存率的影响

百草枯会导致辅酶耗尽与活性氧自由基的产生[8]，使机体产生多种应激反应，进一步释放氧自由基、蛋白水解酶等物质，从而加重生物体组织内损伤[9]。喂食NaCl 会导致肠道中积累大量的免疫细胞，促炎性细胞因子增加，严重时还可加剧神经炎症[10]。同时高盐环境会使果蝇肠道的微生物菌群紊乱，从而降低果蝇的运动能力与生存率[11]。

喂食PQ 组4 d 后的生存率为2.22%，但添加了10%八宝景天水提物的果蝇生存率为34.44%，两组相比，添加八宝景天水提物组果蝇生存率增加了32.22%，也具有较大差异（P＜0.000 1）（图 1 B）。培养至 5 d 时，与 PQ 组（生存率 0%）相比，添加了10%八宝景天水提物组的果蝇仍有存活，且存活率达到20.00%。此外，喂食NaCl 组6 d 后，果蝇生存率为13.33%，但添加了10% 八宝景天水提物的果蝇生存率为56.67%，与喂食NaCl 组相比，添加八宝景天水提物组果蝇生存率增加了43.34%，也具有很大差异（P＜0.000 1）（图1 C）。本组结果说明八宝景天水提物能够显著抵御致炎因子对果蝇的损害作用，并由此延长果蝇的存活时间。

3.2 八宝景天水提物对致炎因子引起的果蝇肠道上皮细胞死亡的影响

结果表明（图2），喂食蔗糖的果蝇肠道中仅能观察到极少数的死亡细胞。经过SDS 长时间诱导处理后，果蝇肠道上皮细胞中死亡细胞数量显著增加（P＜0.000 1）。但是，添加八宝景天水提物后，肠道死亡细胞数量显著减少，与喂食蔗糖组接近（P＜0.01）。由此可知，八宝景天可以非常有效地缓解致炎因子SDS 所造成的肠道上皮细胞大量死亡现象，从而缓解果蝇肠道由于外来因子诱导产生的损伤。

图2 八宝景天对SDS诱导的果蝇肠道上皮细胞死亡数量的影响

3.3 八宝景天水提物对降低果蝇肠道内过量RROOSS的作用

正常情况，生物体内ROS 处于不断产生与被抗氧化系统清除的状态，整体保持动态平衡[12]。活性氧自由基使双层膜结构受到破坏并且对细胞器结构和功能产生损害，继而损伤蛋白质、脂质等生物大分子[13]。果蝇肠道在应对如SDS 等诱导因子产生的炎症反应过程中会产生过量的ROS，引起肠道细胞损伤[14]。因此，利用DHE 染色标记不同条件下果蝇肠道细胞内ROS 的含量（图3），便于观察与统计分析不同条件下果蝇肠道上皮细胞内ROS 的水平差异。结果表明，在正常条件下，果蝇肠道上皮细胞内ROS 含量很少，经SDS 诱导48 h 后，果蝇肠道内ROS 水平显著升高，而添加八宝景天水提物后，果蝇肠道内 ROS 含量明显减少（P＜0.000 1）。该结果表明，八宝景天水提物可以清除过量的ROS，缓解由致炎因子诱导而引起的肠道内ROS 水平上升的情况，避免过多的ROS 对肠道细胞造成损伤。

图3 八宝景天对SDS诱导的果蝇肠道上皮细胞ROS水平的影响

3.4 八宝景天水提物对致炎因子引起的果蝇肠道前体细胞的影响

SDS 等致炎因子诱导肠道干细胞过度增殖和分化，从而破坏肠道稳态[7]。本试验所用的esg-Gal4 USP-GFP转基因果蝇中，其自身携带的绿色荧光蛋白（GFP）能特异性标记肠道干细胞（ISC）和肠下皮细胞（EB）[15]。当喂食蔗糖时，果蝇肠道内前体细胞（ISC 和EB）大小与数目为正常水平。经致炎因子诱导以后，肠道中的GFP 阳性细胞相对面积明显增大，而且数量显著增加（P＜0.000 1）。但是，添加八宝景天水提物后，肠道中的GFP 阳性细胞相对面积显著减小，与SDS 组相比数目显著降低，与只喂食蔗糖组的正常水平几乎没有区别。此结果表明，八宝景天水提物可以有效地抑制由SDS 诱导的果蝇肠道内阳性细胞面积变大及前体细胞数量过度增加的现象，抑制其促进过度增殖和分化的活性（图 4）。

图4 八宝景天对SDS诱导后果蝇肠道前体细胞的影响

3.5 果蝇肠道形态变化

喂食SDS 诱导肠道细胞死亡，同时导致ROS水平升高，并引起肠道干细胞过度增殖和分化。以上生理活动都有可能引起肠道形态发生变化，因此分析八宝景天水提物对肠道长度的影响。随机收集诱导后的果蝇并分离肠道，在显微镜下观察果蝇肠道形态变化。喂食SDS 的果蝇和只喂食蔗糖的正常果蝇相比，喂食SDS 的果蝇肠道长度明显缩短35.44%（P＜0.000 1）；而添加八宝景天水提物组的果蝇肠道长度比只喂食蔗糖的正常果蝇肠道长度缩短 6.63%（P＞0.05），且比喂食 SDS 的果蝇肠道长度增加了 44.62%（P＜0.001）（图 5）。此结果也证明了八宝景天水提物可保护肠道上皮细胞免受SDS 诱导的炎症损伤，抑制肠道长度的缩短。

图5 八宝景天对SDS诱导后果蝇肠道形态的影响

4 讨 论

果蝇肠道干细胞可以分化出同类ISC 与EB 细胞，而EB 细胞可以分化出EC 细胞与EE 细胞[15]。在正常条件下干细胞的增殖与分化活性较低，但是当肠道受到来自外源的病原体或致炎因子的刺激后，其干细胞增殖与分化的活性明显增强[7]。果蝇喂食SDS 后，肠道干细胞增殖和分化速度显著提高，其目的是补充凋亡或死亡的肠道上皮细胞，从而降低肠道损伤。但是，肠道上皮细胞过度的增殖与分化会破坏肠道内环境稳态。肠道干细胞通过过度增殖分化以应对SDS 诱导产生的氧化应激，但在此过程中产生过量的ROS 会对肠道细胞造成损伤[16]。本试验结果表明，八宝景天水提物能提高致炎因子SDS 诱导损伤后的果蝇生存率，缓解致炎因子诱导的上皮细胞大量死亡情况，降低肠道内过量的活性氧（ROS）的水平，抑制前体细胞过度增殖与分化现象，维持肠道形态，从而保护肠道上皮细胞免受诱导损伤，维持肠道内稳态。由此可见，八宝景天可以缓解由致炎因子SDS 所造成的肠道损伤。果蝇的消化系统在干细胞形态与功能方面和脊椎动物存在一定的相似性[17]。本试验结果在研究八宝景天对肠道上皮细胞的保护作用，开发相关治疗药物等方面具有一定的参考意义。