基于DigiGait成像系统的帕金森病模型大鼠行为学分析

刘欣昊，马书杰，丁道芳，罗开亮，马欣然，姜汶伶，胡 军，*

1 上海中医药大学康复医学院，上海 201203；2 上海市第二康复医院，上海 200441

帕金森病（Parkinson's disease，PD）作为全球第二大慢性退行性神经系统疾病［1］，造成的社会负担在不断增加。流行病学调查显示，PD全人群患病率约0.3%［2］。PD 的临床表现主要包括运动症状与非运动症状两大类［3］，其中由于患者步幅长度缩短、步行速度减缓、迈步频率减小等引起的步行功能障碍是PD 运动症状的典型表现之一［4-6］。PD 运动症状的发病机制仍不清楚，目前的康复治疗手段只能延缓症状的发生，但无法根治。PD动物模型的建立对探究PD 运动症状的发病机制及康复治疗的作用机制至关重要，相关研究也得到了广泛关注［7-8］。其中，PD 动物模型的行为学研究能更直观地表现PD的运动症状，为筛选更有效的康复治疗手段提供理论依据，因此行为学的检测方式和指标选择成为了研究的热点。PD 动物模型行为学检测的主要内容包括肌力、协调功能、运动功能等，如悬挂实验可评价动物的协调功能；旷场实验可测试动物的运动距离及平均速度；步距实验可检测动物的平均步长等［9-11］。但现有的检测方法可能存在结果单一、耗时长、出现运动习惯等问题，这对分析结果可能产生较大影响。

DigiGait 成像系统作为一种新型动物行为学检测手段，能从空间子成分、时间子成分、姿势子成分3 个维度进行分析［12］，具有多重结果、单次测量、无损害等优点，并根据其系统的独特性直接针对模型的平衡及协调功能进行量化分析。因此，本研究将运用DigiGait 成像系统对6-羟基多巴胺（6-Hydroxydopamine，6-OHDA）诱导的PD 模型大鼠进行行为学分析，探讨该方法应用于PD 相关基础研究中的潜力。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择清洁级雄性SD 大鼠24只，6～8周龄，体质量（160～200）g，由上海中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006。饲养环境：动物房温度（23±2）℃，相对湿度60%～65%。本实验方案经上海中医药大学动物实验中心伦理委员会批准（审批号：PZSHUTCM201204004）。

1.2 主要实验试剂及仪器

DigiGait 成像系统（美国Mouse Specifics 公司，型号：MSI-SOF-DIG）；增强型小动物麻醉机（型号：R540）、异氟烷（批号：R510-22）、大鼠脑立体定位仪（型号：68018）均购自深圳瑞沃德生命科技有限公司；微量进样器（上海高鸽工贸有限公司，规格：5 μL）；小动物颅骨钻（深圳赛德克斯医疗科技有限公司，型号：78001）；6-羟基多巴胺（批号：MKCJ2199）、抗坏血酸（批号：WXBD2611V）、阿扑吗啡（批号：LRAC 4767）均购自美国Sigma公司。

1.3 模型制备和分组

1.3.1 实验分组 大鼠适应性饲养7 d后，按随机数字表法分为正常组、模型组及假手术组，每组8只。

1.3.2 模型制备 模型组采用单侧2点法脑注射6-OHDA 诱导建立PD 大鼠模型［13-14］。异氟烷气体麻醉大鼠并固定于脑立体定位仪上，暴露颅骨，确定2 个定位点（第1 定位点：前囟后5.2 mm，中线右侧1.0 mm，硬膜下9 mm；第2 定位点：前囟后5.2 mm，中线右侧1.5 mm，硬膜下8.5 mm）并标记。轻缓钻透颅骨，用微量注射器抽取浓度为2 μg/μL 的6-OHDA 溶液（使用含0.2%抗坏血酸溶液配制），每定位点注射3 μL。其中进针速度1 mm/min，注射速度1 μL/min，留针时间5 min，退针速度1 mm/min，所有操作完成后缝合皮肤。假手术组采用相同定位及注射方式注射同等剂量的0.2%抗坏血酸溶液建立假手术模型。模型制备手术后第7 天，通过腹腔注射0.5 mg/kg阿扑吗啡，诱导其进行旋转测试判定PD 模型大鼠的制备情况（旋转圈数＞7 次/min 表明模型合格）［15］。正常组不进行任何手术处理。

1.4 观察指标

运用DigiGait成像系统检测各组大鼠行为，评估前跑台适应性训练3 d。检测时大鼠可自由穿行在预设长度的透明跑带上，跑带速度为10 m/min［16］，通过跑带下方的摄像机连接成像系统自动识别大鼠4只脚底部的颜色，同步进行描绘处理，提供包含时间子成分（摆动时长、制动时长、触地时长、站立系数）、空间子成分（步幅频率、步幅长度、触地宽度、步态对称性、脚爪重叠距离、脚爪放置定位）及姿势子成分（脚爪角度、步偏角、脚爪面积）等3个维度的生理学步态信号参数［17］，其中步态对称性作为协调功能特定指标，脚爪放置定位作为平衡功能特定指标。

1.5 统计学方法

采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析，计量资料服从正态分布，数据以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组跑带运动步态时间子成分变化比较

与正常组比较，假手术组跑带运动步态时间子成分无明显变化（P＞0.05）；模型组左前肢、左后肢及右前肢在运动过程中的摆动时长、制动时长及触地时长明显延长（P＜0.05），右后肢制动时长及摆动时长明显延长（P＜0.05）。与假手术组比较，模型组左前肢、左后肢及右前肢在运动过程中的摆动时长、制动时长及触地时长明显更长（P＜0.05），右后肢制动时长明显更长（P＜0.05）。见表1。

表1 3组跑带运动步态时间子成分比较（±s）Table 1 Comparison of time subcomponents in three groups（±s）

表1 3组跑带运动步态时间子成分比较（±s）Table 1 Comparison of time subcomponents in three groups（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与假手术组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the sham operation group,2)P＜0.05.

组别正常组假手术组模型组n 8 8 8肢体部位左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢摆动时长/s 0.0 9 0±0.0 2 6 0.0 9 4±0.0 5 2 0.0 8 9±0.0 1 7 0.0 8 1±0.0 1 4 0.1 3 0±0.0 2 6 0.0 9 9±0.0 4 5 0.1 2 0±0.0 2 6 0.1 2 4±0.0 3 9 0.1 6 5±0.0 3 4 1）2）0.1 2 6±0.0 7 1 1）2）0.1 8 5±0.0 2 0 1）2）0.1 4 1±0.0 1 9 1）制动时长/s 0.1 2 3±0.0 1 4 0.1 2 1±0.1 0 3 0.1 1 6±0.0 6 6 0.0 8 8±0.0 5 0 0.0 8 4±0.0 1 2 0.1 8 7±0.0 9 1 0.0 8 2±0.0 4 0 0.0 7 9±0.0 4 7 0.1 8 2±0.0 7 3 1）2）0.2 2 9±0.1 2 3 1）2）0.1 5 1±0.0 2 0 1）2）0.1 5 8±0.0 5 2 1）2）触地时长/s 0.3 9 2±0.1 1 9 0.4 1 0±0.1 2 3 0.3 0 8±0.0 4 2 0.3 3 2±0.0 3 9 0.4 2 8±0.1 3 7 0.4 6 0±0.0 9 5 0.4 5 9±0.0 5 2 0.4 3 2±0.1 1 2 0.7 8 1±0.1 1 3 1）2）0.5 9 8±0.1 1 7 1）2）0.6 6 8±0.1 1 9 1）2）0.4 1 0±0.0 8 8站立系数1.1 6 3±0.4 4 3 0.9 4 8±0.2 2 7 0.9 3 4±0.2 1 6 0.9 4 4±0.1 3 8 0.8 8 1±0.2 6 7 0.8 9 3±0.2 2 2

2.2 3组跑带运动步态空间子成分变化比较

与正常组比较，假手术组跑带运动步态空间子成分无明显变化（P＞0.05）；模型组前后肢触地宽度明显增加（P＜0.05），四肢的步幅频率、左侧肢步幅长度及大鼠的脚爪放置位置与步态对称性明显降低（P＜0.05），但右侧肢步长和左右侧肢的脚爪重叠距离无明显变化（P＞0.05）。与假手术组比较，模型组前后肢触地宽度明显增加（P＜0.05），四肢的步幅频率、左侧肢步幅长度及大鼠的脚爪放置位置与步态对称性明显降低（P＜0.05），但右侧肢步幅长度和左右侧肢的脚爪重叠距离无明显变化（P＞0.05）。见表2。

表2 3组跑带运动步态空间子成分比较（±s）Table 2 Comparison of spatial subcomponents in three groups（±s）

表2 3组跑带运动步态空间子成分比较（±s）Table 2 Comparison of spatial subcomponents in three groups（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与假手术组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the sham operation group,2)P＜0.05.

组别正常组假手术组模型组n 8 8 8肢体左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢步幅频率/（步/s）2.4 5 0±0.9 1 1 2.5 6 2±0.3 6 6 2.5 7 5±0.2 3 7 2.4 5 0±0.2 4 5 2.8 8 7±0.3 9 7 2.5 5 5±0.3 0 0 2.5 2 9±0.2 6 2 2.5 6 1±0.3 3 3 1.7 2 5±0.3 8 5 1）2）2.0 5 6±0.4 2 3 1）2）1.7 6 2±1.0 1 6 1）2）2.0 7 0±0.3 2 6 1）2）步幅长度/c m 1 1.1 6 2±2.8 0 1 1 1.8 5 6±2.3 9 0 1 1.6 0 0±1.4 7 0 1 2.5 0 0±2.6 8 3 9.7 5 0±1.6 8 6 9.6 8 8±1.5 3 6 8.8 6 2±0.8 5 1 9.1 3 8±0.7 1 3 5.2 0 0±1.2 3 4 1）2）8.9 2 8±2.6 6 0 6.7 2 9±2.3 4 3 1）2）8.6 8 6±1.5 2 5触地宽度/c m 2.3 6±0.3 3 1.8 3±0.8 8 2.0 4±0.3 8 2.6 6±0.4 1 2.8 3±0.4 7 1）2）3.4 3±0.6 2 1）2）组别正常组假手术组模型组n 8 8 8脚爪重叠距离/c m左侧-1.3 1±2.2 1-1.4 3±2.8 3-1.4 3±2.8 3右侧0.6 5±2.0 5 0.3 2±1.3 0 0.3 2±1.3 0脚爪放置位置/c m左侧0.3 1 5±0.3 7 7 0.4 2 5±0.4 8 2-0.3 3 4±0.4 1 3 1）2）右侧0.3 9 1±2.1 3 0 0.4 6 9±1.1 7 3-0.2 7 3±1.7 6 4 1）2）步态对称性0.9 9 4±0.1 0 1 1.0 0 8±0.0 6 5 0.6 4 9±0.1 3 1 1）2）

2.3 3组跑带运动步态姿势子成分变化比较

与正常组比较，假手术组跑带运动步态姿势子成分无明显变化（P＞0.05）；模型组在运动过程中左前肢、左后肢及右后肢与跑带接触脚爪面积明显减少（P＜0.05），右前肢与跑带接触脚爪面积、脚爪角度及步偏角均无明显差异（P＞0.05）。与假手术组比较，模型组在运动过程中左前肢、左后肢及右后肢与跑带接触的脚爪面积明显减少（P＜0.05），右前肢与跑带接触的脚爪面积、脚爪角度及步偏角均无明显区别，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 3组跑带运动步态姿势子成分比较（±s）Table 3 Comparison of postural subcomponents in three groups（±s）

表3 3组跑带运动步态姿势子成分比较（±s）Table 3 Comparison of postural subcomponents in three groups（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与假手术组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the sham operation group,2)P＜0.05.

组别正常组假手术组模型组n 8 8 8肢体左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢左前肢右前肢左后肢右后肢脚爪角度/°6.9 3 8±5.0 2 9 8.6 8 8±3.2 4 4 5.6 0 0±4.4 8 0 7.1 1 3±5.9 4 9 5.3 7 5±2.0 6 3 7.0 2 2±3.7 4 0 5.4 6 2±3.8 6 9 7.3 4 2±5.7 1 2 6.6 1 3±5.5 7 5 7.5 2 9±4.6 1 4 6.9 7 1±5.9 8 2 6.4 1 4±4.7 4 0脚爪面积/c m 2 3.7 6 8±1.7 2 1 3.4 7 6±1.5 4 8 6.0 2 8±1.8 5 2 5.9 4 5±1.8 0 1 4.6 6 6±0.3 8 7 3.3 9 7±0.5 2 9 6.7 7 0±0.5 9 2 6.5 6 6±0.7 2 5 2.2 7 1±0.9 3 9 1）2）2.7 7 7±1.4 0 4 4.5 1 0±2.1 3 5 1）2）5.0 1 9±2.1 7 7 1）2）步偏角/°6 6.1 2±7.3 9 7 2.9 8±9.7 7 7 1.2 2±6.1 1 6 8.9 2±6.9 9 6 5.3 7±7.2 8 5 6.8 7±1 0.2 7

3 讨 论

3.1 DigiGait 成像系统可反映PD 模型大鼠的步行功能障碍

步行功能与日常生活活动能力具有密切关系，因此，改善步行功能障碍是PD 患者康复治疗过程的重点。本研究观察到PD 模型大鼠出现脚底拖拽、步长缩短、步速降低等步态，通过DigiGait 成像系统检测发现PD 模型大鼠的步长、步频明显减小，而摆动时间、制动时间及触地时间却明显延长。这与临床上PD 患者出现的步行功能障碍“冻结步态”相一致，其主要表现为整体速度降低，手臂摆动减少，步幅缩短，站立阶段持续时间增加，双下肢与地面呈粘连状态、无法起步或起步困难等［18-19］。这提示，DigiGait 成像系统能有效检测6-OHDA 诱导的PD 模型大鼠的步行功能障碍，同时也可作为PD 模型大鼠训练干预后的评价指标，为PD 运动症状的临床基础研究提供可靠的行为学研究参数。

3.2 DigiGait 成像系统可反映PD 模型大鼠平衡与协调功能的退化情况

平衡、协调功能障碍是PD 常见的运动症状之一，DigiGait 成像系统通过特有的步态对称性和脚爪放置定位指标来评价模型的协调功能及平衡功能。本研究结果显示，PD模型大鼠在运动过程中出现跌倒或步态不稳等现象，但未达到单侧脊髓损伤后完全瘫痪的程度［20-22］。DigiGait 成像系统显示，PD 模型大鼠的协调、平衡功能均下降，触地宽度增加，这与PD 大鼠出现因自动姿势反应调整不及时（肢体肌力下降、前庭功能减退、本体感觉缺失等因素）导致的重心不稳、躯体前倾、肢体摇摆等表现一致［23］。单侧脑注射6-OHDA［24］所制备的PD 模型具有临床上PD 患者所出现的运动迟缓、运动控制能力下降等问题，并且左右侧肢体症状比较更明显，更利于研究者观察分析。这提示，DigiGait 成像系统所特有的协调及平衡功能检测指标可以更科学、简便地评价PD 模型大鼠的协调、平衡功能，以弥补PD动物实验中评价行为学整体表现的不足。

3.3 DigiGait 成像系统可应用于PD 模型大鼠的行为学研究

随着病程的延长，PD 患者逐渐出现跌倒等症状，此时药物治疗效果不显著且病情逐渐不可逆，因此非药物干预（如早期康复治疗手段）成为改善PD患者临床症状的关键。运动干预、神经调控技术等作为典型的非药物治疗手段能有效改善机体运动功能及神经可塑性［25-26］，从而进一步激活相应感觉运动脑区，促进肌肉本体感觉的恢复，进而增强肌肉力量，逐步恢复运动控制能力，提升平衡、协调功能以达到改善PD 运动症状的目的。但在目前针对PD 的基础研究中，尚缺乏能多维度评价治疗效果的行为学检测方法。本研究结果显示，DigiGait成像系统能高效、准确地反映PD 模型大鼠运动功能的变化情况。因此，课题组认为可以运用Digi-Gait 成像系统的检测优势开展多种研究：①筛选改善PD 模型大鼠行为学的有效干预方法；②针对同一干预方法，设立不同的检测时间节点进行周期性运动监测，筛选改善PD 模型大鼠行为学的最佳干预周期；③DigiGait 成像系统能在形态学、影像学、分子生物学等检测手段的基础上提供更为直观的行为学检测数据，更好地反映PD 治疗新技术的临床疗效。

4 小 结

DigiGait 成像系统可以从空间子成分、时间子成分、姿势子成分等3个维度客观评价PD 模型大鼠步行功能、平衡功能及协调功能，在PD 相关基础研究中具有广泛的应用潜力。