秘鲁外海茎柔鱼脂肪酸组成的月间差异研究

赵振方,胡贯宇,2,3,4,5,6*,陈新军,3,4,5,6,刘必林,3,4,5,6,梁佳伟

(1.上海海洋大学 海洋科学学院，上海 201306；2.同济大学 海洋地质国家重点实验室，上海 200092；3.上海海洋大学 大洋渔业资源可持续开发教育部重点实验室，上海 201306；4.上海海洋大学 国家远洋渔业工程技术研究中心，上海 201306；5.上海海洋大学 农业农村部大洋渔业开发重点实验室，上海201306；6.农业农村部大洋渔业资源环境科学观测实验站，上海 201306)

引 言

茎柔鱼(Dosidicusgigas)，是东太平洋特有的头足类动物[1-3]。与其它鱼种不同，茎柔鱼可食用率较高(75%)，脂肪含量低，营养价值高[4]。其特点是生长迅速、生命周期短(1～2年)、对环境变化的适应性强[2, 5]。FAO统计数据表明，过去30 a中，茎柔鱼捕获量呈明显的波动上升趋势，2019年产量近94万t。茎柔鱼是一种极其活跃的捕食者，通常以甲壳类、鱼类和头足类动物为食[6]。此外，它还是一种非选择性捕食者，具有较宽的营养生态位和很高的摄食率[7-8]；食性变化与体型、地理区域和季节变化有关[9-10]。作为捕食者和被捕食者，茎柔鱼处于食物网中的关键环节，在海洋生态系统的营养结构中发挥着关键能量流动作用[11]。海洋生物的摄食生态揭示了海洋食物网的基本结构，承载了食物网绝大部分的物质和能量流动[12]。因此，茎柔鱼的摄食生态成为研究海洋食物网的重要环节。

研究摄食生态的传统方法为胃含物分析法[13-14]，早在上个世纪初，Reed[15]等就已经对胃含物分析法做出详细阐述。但由于传统的胃含物分析仅能对生物48 h甚至24 h内的摄食状况进行反应，对研究海洋生物长时间的摄食情况帮助甚少。而脂肪酸分析法能够反映该物种两周内甚至更长时间段的摄食情况。因此，脂肪酸分析法现被广泛应用于海洋生物的摄食生态的研究。贡艺等[9]利用脂肪酸分析法对智利外海、秘鲁外海以及中东太平洋赤道海域的茎柔鱼食性进行了研究，发现脂肪酸组成的空间异质性主要是由各海区 C16∶0、C18∶2n6、C20∶4n6 和 DHA 的含量不同造成的。Chen等[16]利用脂肪酸分析法，研究雌性茎柔鱼繁殖时期的能量积累和饮食策略，研究发现茎柔鱼繁殖时期能量主要来源于直接摄食，而体细胞储备再利用较为有限。虽然已有学者使用脂肪酸分析法来探究茎柔鱼的摄食生态，但考虑到茎柔鱼短暂的生命周期，目前仍缺少从时间尺度对其进行对比分析。因此，本研究以在秘鲁外海5、6、10和11月捕获的茎柔鱼为对象，对其肌肉脂肪酸进行测定并加以分析，旨在探究秘鲁外海茎柔鱼不同月份间脂肪酸组成及差异，探讨在不同月份其食性的差异。

1 材料与方法

1.1 样本采集

本实验样本采集于东太平洋秘鲁外海(80°57′～ 85°35′W、09°18′～18°55′S)，采样时间为2020年5、6、10和11月。样本采集后经冷冻运输船运回实验室，在-20℃冷库中储存[17]。研究表明，茎柔鱼为机会主义捕食者，个体大小、性别对其摄食影响较小[2,18]，因此，本研究样本从4个月份捕捞上岸的茎柔鱼中随机挑选。

表1 不同月份茎柔鱼样本组成

1.2 样本处理

在实验室解冻后，按月份对样本进行随机挑选，测量胴长和体重，去除内脏后，取茎柔鱼胴体漏斗锁软骨处的肌肉3 cm×3 cm。去除表皮，用超纯水漂洗后放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，将干燥后的肌肉组织研磨成粉。

取0.2 g粉末样品于试管中，加入15 ml二氯甲烷-甲醇溶液(体积比为2∶1)浸泡20 h以上。离心后取上清液于具塞试管中，再加入10 ml三氯甲烷-甲醇混合溶液冲洗残渣，离心取上清液，合并两次收集的上清液加入4 ml 0.9%的氯化钠溶液，静置2 h。取下层溶液于圆底烧瓶中进行水浴蒸发，得到粗脂肪样品[19]。

在圆底烧瓶中加入4 ml氢氧化钾-甲醇溶液(0.5 mol/L)，混合后连接水浴回流装置(100 ℃)，水浴加热15～20 min，加入4 ml三氟化硼-甲醇溶液煮沸25～30 min，最后加入4 ml正己烷回流萃取2 min；冷却后加入20～30 ml氯化钠饱和溶液，摇晃均匀，将溶液倒入试管中静置分层1～2 min，用注射器吸取一定量的正己烷层留待测量。

1.3 数据处理

实验数据结果以平均值 ± 标准差( Mean ±Sd) 表示，脂肪酸组成采用内标法进行定量分析。每种脂肪酸以占各脂肪酸总含量的百分比表示。使用R软件的scale函数对样本的脂肪酸百分含量数据进行标准化。将标准化后的数据按月份分组后进行非度量多为尺度(NMDS)分析，根据NMDS散点图分析不同月份茎柔鱼肌肉脂肪酸组成的时间差异，根据脂肪酸NMDS载荷强度分析造成差异的主要脂肪酸种类[20,21]。采用Bray-Curtis相似性系数，以相似性分析(ANOSIM)对比不同月份茎柔鱼脂肪酸组成差异的大小，以P<0.05作为具有显著性差异的判断标准[9,22]。以上分析、绘图均使用R 4.0.5完成。

1.4 指示食性的特征脂肪酸

特征脂肪酸有指示生物食性的作用，并结合现有脂肪酸标志体系[23-27]，分析肌肉中特征脂肪酸组成与月份的关系，进一步探究样本的食性。

图1 茎柔鱼体长-质量关系

2 结果

2.1 胴长体重关系

四个月份茎柔鱼胴长范围为122～627 mm，平均胴长为(369.3±167.2) mm，体质量范围为119～7 911 g，平均质量为(2 622.3±2 574)g。体长-质量关系为W= 8e-05L2.8472(R2= 0.9467，n=41，p<0.01)(W为体质量，L为胴长，n为样本数)。

2.2 茎柔鱼肌肉脂肪含量和脂肪酸组成

本研究中，4个月份茎柔鱼肌肉中所含脂肪酸种类相同，共检测到28种脂肪酸(表 2)，包括10种饱和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)，8种单饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid, MUFA)和10种多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)。其中多不饱和脂肪酸含量最高，其次为饱和脂肪酸，而单不饱和脂肪酸含量最少。4个月份茎柔鱼肌肉SFA含量为29.18%～31.65%，其中C16∶0和C18∶0含量较高，占据所有SFA的83.2%～91.3%；MUFA含量为8.52%～10.31%，其中C20∶1含量较高，占据所有MUFA的58.0%～68.4%；PUFA含量为59.40%～60.85%，而C22∶6n3(DHA)是 PUFA 的主要存在形式(>73.2%)。

表2 茎柔鱼肌肉脂肪酸组成

续表2

2.3 茎柔鱼肌肉脂肪酸组成的时间差异

一方面，ANOSIM 显示，饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸在4个月之间的差异均不显著(P>0.05)；而单不饱和脂肪酸的差异显著(P<0.05)，其中10月单不饱和脂肪酸含量最高(10.31%)，6月含量最低(8.52%)。检测到的28种脂肪酸中，10种脂肪酸的含量在月份间存在极显著差异(P<0.01)，分别为C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶1n9、C20∶1、C20∶3n3、C20∶4n6、EPA、C22∶2n6；另有C18∶0的含量在月份间的差异性显著(P<0.05)。

另一方面，NMDS 排序图表明，5月和 6月茎柔鱼脂肪酸组成的置信椭圆重叠明显(图 2)，主要脂肪酸组成差异不显著(P>0.05)(表 3)。同样，10月、11月脂肪酸组成差异也不显著(P>0.05)。此外，5、6两月的散点明显的区分于10、11两月，且置信椭圆未有重叠，表明5、6月份与10、11月份的主要脂肪酸组成差异显著。而根据NMDS主要矩阵向量组成(表 4)以及主要向量的相对加载强度和方向(图 3)可以看出，C16∶0、C18∶0、C18∶1n9、C20∶1、C20∶5n3、C22∶2n6、C22∶6n3为造成脂肪酸月间差异性的主要脂肪酸，C18∶0、C20∶1可以较明显的体现10月样本的脂肪酸特征，C16∶0则更多体现6月样本的脂肪酸特征。

表3 月份间脂肪酸组成相似性分析(ANOSIM)

表4 NMDS主要矩阵向量组成

图2 不同月份间茎柔鱼肌肉脂肪酸组成的NMDS散点分布

图3 不同月份茎柔鱼肌肉脂肪酸组成的NMDS标度

2.4 特征脂肪酸及食性差异

通过对比分析特征脂肪酸百分含量与月份的变化关系(表 2)，6月C20∶4n6 出现高值，且5、6月份 C20∶4n6含量均大于1%，明显高于10月、11月。DHA含量最高值也出现在6月，但4个月份无显著差异(P=0.571)。C18∶ 1n9 和C16∶1n7 的最高值均出现在5月，11月份出现最低值，且4个月份中C18∶ 1n9含量均高于1%。10、11月C20∶5n3 含量较高，均大于9%，明显高于5月和6月。茎柔鱼肌肉脂肪酸中DHA含量最多，4个月份均大于40%，而5、6、10、11月DHA/EPA分别为5.82、5.84、4.54、4.83。

3 讨论与分析

本研究通过对比4个不同月份茎柔鱼肌肉脂肪酸组成，分析发现，茎柔鱼肌肉组织中共有28种脂肪酸，其中SFA、PUFA各10种，MUFA 8种，这与贡艺[9]等的研究结果一致。各月份SFA、PUFA、MUFA含量虽有差异，但均以PUFA为主，其次是SFA，MUFA含量最低。作为必须脂肪酸，DHA和EPA对维持茎柔鱼正常生长发育起到关键作用。本研究发现，茎柔鱼肌肉中DHA与EPA含量较高，占多不饱和脂肪酸的二分之一以上，且 n-3 型多不饱和脂肪酸含量明显高于 n-6型多不饱和脂肪酸。由于 n-3/n-6是鱼油相对营养价值的重要指标[28]，高含量的n-3/n-6 证明了茎柔鱼较高的营养价值。

以往研究中，已有学者使用脂肪酸组成分析法从不同地理群体[9]、生殖投入[16]等方面来探究茎柔鱼的摄食生态，而本研究则是从时间角度来分析茎柔鱼的摄食变化。

本研究发现，5月和6月、10月和11月茎柔鱼肌肉脂肪酸组成差异不显著，由于茎柔鱼摄食受温度、叶绿素浓度等环境因子的影响[29]，因此，相邻两月较为相似的外部环境特征可能是其脂肪酸组成相似的主要原因。然而，5、6两月与10、11两月肌肉脂肪酸组成差异明显(图 2)，这种差异首先体现在饱和脂肪上(P=0.042)，饱和脂肪酸可以自身合成，因此，通过摄食很难对其进行解释。5、6月南半球处于秋冬季节，温度较低，茎柔鱼可获取的食物相对较少，为保持体内能量，储存能量的脂肪可能相应增加，从而导致5、6月份茎柔鱼饱和脂肪酸含量显著高于10、11月份。

此外，多不饱和脂肪酸不能自身合成，只能从食物中摄取[30]，因此可以很好的指示食物来源。本研究显示，各个月份多不饱和脂肪酸组成种类相同，但其中C20∶3n3、C20∶4n6、C20∶5n3、C22∶2n6 4种多不饱和脂肪酸月份间差异显著(表 2)。本研究认为，不同月份茎柔鱼所摄食猎物种类一致，但4个月份间摄食不同猎物的比例有所差异。Alegre等[29]通过胃含物分析研究秘鲁海域茎柔鱼一年中摄食组成变化，同样发现，茎柔鱼四个季节摄食物种种类基本一致，但不同季节食物组成比例有所差异，如春季其他头足类为最主要的食物，而秋季则对荧光串鱼有更强的摄食偏好。

表5 特征脂肪酸及其指示生物

由于生物体内的脂肪酸组成在很大程度上取决于其摄食对象的脂肪酸特征[31]，且特征脂肪酸具有指示食性的作用，其组成和含量可以较好地指示它们的食物来源(表5)。本研究中，5、6月份C22∶6n-3/ C20∶5n-3比值显著高于10、11月份，表明5、6月份秘鲁海域茎柔鱼比10、11月份更多地摄食桡足类或以桡足类为主要食物的物种。此外，5、6月份指示浮游生物的特殊脂肪酸 C18∶1n9 也明显高于10、11月份。已有研究表明，竹筴鱼的主要摄食对象为桡足类、浮游生物、小型鱼类[32-33]，而Cecilia等[34]对秘鲁海域茎柔鱼进行胃含物分析，发现茎柔鱼胃含物组成中竹筴鱼(Trachurusmurphyi)无论是在出现频次、数量还是重量上都显著超过其他种类。由此推断，C22∶6n-3/ C20∶5n-3、C18∶1n9间接指示了秘鲁海域茎柔鱼的竹筴鱼食性，且5、6月份对竹筴鱼有更强的摄食偏好。除此之外，6月份脂肪酸C20∶4n6组成比例明显高于其余3个月，说明秘鲁茎柔鱼6月摄食更多的底栖生物。根据Stewart等[35]研究，茎柔鱼垂直洄游受到最小含氧层(Oxygen Minimum Zone，OMZ)的影响，OMZ的上层深度往往是茎柔鱼下潜的最大深度。而东南太平洋冬季OMZ宽度增加，但其上边界则会下移至较深的位置[36]，因此冬季茎柔鱼可能在较深的海域滞留时间相比于其他季节更长，从而捕食更多的底栖生物。此外，由于DHA/EPA会随营养级的增加而增加，因此DHA/EPA可以间接指示生物营养级[37-38]，5、6、10、11月茎柔鱼DHA/EPA分别为5.82、5.84、4.54、4.83，5、 6两月茎柔鱼营养级高于10、11月，因此，茎柔鱼在5、6月份可能捕食更多的底栖生物。

本研究通过测定2020年4个月份捕获自秘鲁外海的茎柔鱼肌肉脂肪酸，分析了不同月份茎柔鱼肌肉脂肪酸组成的特点和差异。研究发现，4个月茎柔鱼脂肪酸均以多不饱和脂肪酸为主，饱和脂肪酸次之，单不饱和脂肪酸最少。5月与10月、5月与11月、6月与10月、6月与11月的脂肪酸组成差异显著。4个月份多不饱和脂肪酸种类相同，但组成比例不同。本研究认为，不同月份茎柔鱼所摄食猎物种类一致，但4个月份间摄食不同猎物的比例有所差异。此外，C22∶6n-3/ C20∶5n-3、C18∶1n9、C20∶4n6等特征脂肪酸组成也显示出显著的月份间差异，本研究认为，5、6月份茎柔鱼对竹筴鱼、底栖生物有更强的摄食偏好，这可能是由海洋环境的月间差异所致。然而，脂肪酸分析同样存在一定的缺陷，其对食性的指示具有一定的间接性，尤其是对浮游生物的指示，并不能确定茎柔鱼直接摄食浮游生物或是摄食以浮游生物为食的其它种类，而传统胃含物分析法也很难检测出浮游生物，因此后续研究可使用DNA序列分析法对其进行补充、验证。另一方面，脂肪酸分析不能确定营养级，后续研究可以结合稳定同位素分析法研究茎柔鱼在海洋生态系统中的营养位置。