β-连环蛋白、赖氨酰氧化酶样蛋白2在骨肉瘤组织中表达的相关性及生物学意义

阿不都赛麦提·麦麦吐逊，艾克白尔·吐逊，阿不都拉·阿不都克依木，麦合木提江·穆海麦提，艾尼·买买提

骨肉瘤是临床常见的原发性恶性肿瘤，多见于青少年，具有恶性程度高、容易早期发生远处转移、整体预后情况不佳、5年生存率低等特点[1-2]。近些年，骨肉瘤发病机制的研究越来越多，β-连环蛋白(β-catenin)是经典Wnt通路中的核心分子，该通路激活后引起β-catenin表达增加并移位进入细胞核，进而调控多种增殖、迁移相关基因的表达，促进细胞的增殖和迁移。一项关于骨肉瘤的临床研究[3]显示，骨肉瘤组织中β-catenin的表达水平增加与疾病的预后有关。另有一项研究[4-5]显示，Wnt通路抑制剂对骨肉瘤细胞的增殖和迁移具有明显的抑制作用。但是，目前β-catenin表达与骨肉瘤预后的关系尚缺乏国内的临床证据及相关报道，在骨肉瘤发病过程中β-catenin的上游调控机制也不十分明确。赖氨酰氧化酶样蛋白2(LOXL2)是LOX家族中参与癌细胞恶性生物学行为调控的成员，已有研究[6]证实其在卵巢癌细胞的增殖、侵袭过程中对Wnt/β-catenin 通路具有激活作用，但LOXL2在骨肉瘤发病中是否参与β-catenin的调控尚不清楚。本研究回顾性分析2012年1月～2017年12月我院82例诊断为骨肉瘤患者的资料，以骨肉瘤细胞株为观察对象，分析β-catenin及LOXL2在骨肉瘤组织中表达的相关性及生物学意义。

1 材料与方法

1.1 病例资料骨肉瘤患者纳入标准：① 接受手术切除并经术后病理诊断为骨肉瘤；② 术后均接受辅助化疗；③ Enneking分期Ⅱ、Ⅲ期；④ 临床病理资料完整；⑤ 随访资料完整。排除标准：① 术前接受过放、化疗；② 既往有其他恶性肿瘤病史。本研究纳入骨肉瘤患者82例，男54例，女28例，年龄7～51(28.67±6.23)岁。另选择同期在我院接受手术切除并经术后病理诊断为骨软骨瘤的52例患者作为对照，男34例，女18例，年龄9～48(30.11±8.93)岁。骨肉瘤与骨软骨瘤患者的性别、年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

1.2 β-catenin、LOXL2表达的Western blot检测取骨肉瘤及骨软骨瘤组织各约30 mg，加入组织裂解液进行匀浆，匀浆液在4 ℃离心机中12 000g离心10 min，收集上清液进行蛋白表达水平的Western blot检测。将蛋白样本与上样缓冲液混合，100 ℃高温变性5 min后加入聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后电转至硝酸纤维素(NC)膜，用5%脱脂牛奶对NC膜进行室温封闭1 h，用β-catenin一抗(1∶1 000稀释,Abcam公司)、LOXL2一抗(1∶1 000 稀释,Abcam公司)或β-actin一抗(1∶5 000稀释,Abcam公司)对NC膜进行4 ℃孵育过夜，次日室温孵育辣根过氧化物酶(HRP)二抗1 h，最后采用增强型化学发光(ECL)试剂盒在凝胶成像系统中进行蛋白显影，得到蛋白条带及灰度值，以β-actin为内参计算β-catenin、LOXL2的表达水平。

1.3 骨肉瘤患者临床资料的收集① 临床资料：性别、年龄、组织类型、病变部位、肿瘤体积、Enneking分期、远处转移。② 随访资料：采用定期复查、电话回访等方式随访患者的生存情况，以死亡或末次随访时间记为总生存期，随访截止日期为2020年3月31日。

1.4 细胞实验培养骨肉瘤细胞株SAOS2，接种在培养板后进行分组：转染NC siRNA为si-NC组，转染LOXL2 siRNA为si-LOXL2组。SAOS2细胞接种在12孔培养板内，分组转染24 h后采用Western blot检测细胞中LOXL2、β-catenin的表达水平；细胞接种在96孔培养板内，分组转染24 h后采用MTS法试剂盒(Promega公司)检测细胞的增殖，染色后在酶标仪上检测490 nm波长处的吸光值(A490 nm)水平；另取转染后24 h的细胞，用不含血清的培养基接种在Transwell的上层小室内，下层小室内加入含有10%胎牛血清的培养基，趋化细胞侵袭12 h后取出上层小室，用结晶紫进行染色并在显微镜下观察，对侵袭细胞进行计数。

2 结果

2.1 骨肉瘤与骨软骨瘤组织中β-catenin、LOXL2表达水平的比较骨肉瘤组织中β-catenin、LOXL2的平均表达水平明显高于骨软骨瘤组织(P<0.05)，见图1。骨肉瘤组织中β-catenin的表达水平与LOXL2的表达水平呈正相关，相关系数r=0.633，相关性分析的散点图见图2。

图1 骨软骨瘤与骨肉瘤组织中β-catenin、LOXL2表达水平的比较 与骨软骨瘤组织比较：*P<0.05 A.β-catenin、LOXL2的电泳图；B.LOXL2的表达;C.β-catenin的表达

图2 骨肉瘤组织中β-catenin与LOXL2表达水平的相关性

2.2 β-catenin、LOXL2在不同临床特征骨肉瘤患者中的表达水平比较见表1。骨肉瘤组织中β-catenin、LOXL2表达水平：不同性别、年龄、组织类型、病变部位患者比较差异均无统计学意义(P>0.05)；不同肿瘤体积、Enneking分期、远处转移患者比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 不同临床特征骨肉瘤患者中β-catenin、LOXL2表达水平的比较

2.3 不同β-catenin、LOXL2表达水平的骨肉瘤患者总生存情况的比较根据骨肉瘤组织中β-catenin、LOXL2的表达水平不同将患者分为高表达组(≥中位数，n=41)、低表达组(<中位数，n=41)，其总生存率的Kaplan-Meier曲线见图3。经Log-Rank检验，骨肉瘤患者中位生存期β-catenin、LOXL2高表达组明显低于低表达组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

图3 不同β-catenin、LOXL2表达水平的骨肉瘤患者总生存率的Kaplan-Meier曲线 A.β-catenin的表达；B.LOXL2的表达

表2 不同β-catenin、LOXL2表达水平的骨肉瘤患者中位生存期的比较

2.4 骨肉瘤细胞株SAOS2中LOXL2靶向调控β-catenin作用的验证见图4。骨肉瘤细胞株SAOS2中LOXL2、β-catenin的表达水平及细胞增殖的A490 nm水平、侵袭细胞的数目si-LOXL2组均明显低(少)于si-NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图4 两组骨肉瘤细胞株SAOS2中LOXL2、β-catenin表达水平及增殖、侵袭的比较 与si-NC组比较：*P<0.05 A.LOXL2、β-catenin的电泳图;B.LOXL2的表达水平；C.β-catenin的表达水平；D.侵袭细胞的结晶紫染色结果(×400)；E.A490 nm的水平；F.侵袭细胞数目的结果

3 讨论

临床治疗骨肉瘤的主要方式是手术切除联合术后辅助化疗，但患者的整体预后情况并不理想，文献[1-2,7-8]显示骨肉瘤的5年生存率为20%～40%。而且骨肉瘤容易发生早期远处转移，与之相关的生物学行为包括肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等。近些年，越来越多的基础研究[9-12]发现了多种不同的骨肉瘤细胞恶性生物学行为调控分子，这些调控分子与骨肉瘤的预后密切相关。

3.1 β-catenin与LOXL2在骨肉瘤组织中表达的临床意义及生物学意义经典Wnt通路是在恶性肿瘤发生发展中起重要作用的信号通路，上游Wnt分子与细胞膜受体Frizzled结合后抑制axin/GSK-3β/APC复合体对β-catenin的降解作用，进而引起β-catenin表达增多并进入细胞核，促进多种增殖、迁移相关基因的表达并改变细胞的生物学行为[13-15]。研究[3-5]显示，Wnt通路抑制剂对骨肉瘤细胞的增殖、迁移均具有抑制作用且β-catenin在骨肉瘤组织中呈高表达趋势。本研究也观察到β-catenin的表达水平骨肉瘤组织明显高于骨软骨瘤组织，提示β-catenin可能参与了骨肉瘤的发生。进一步分析可知，随着肿瘤体积增大、Enneking分期增加、远处转移的发生，骨肉瘤组织中β-catenin的表达水平明显增加，提示β-catenin的高表达促进了骨肉瘤的病理进展。虽然目前β-catenin在骨肉瘤发生发展中的作用明确，但调控β-catenin的上游机制尚不明确。LOXL2在食管癌、结直肠癌、肝癌等多种恶性肿瘤组织中表达增加[16-18]，且冯珊珊 等[6]研究证实卵巢癌中LOXL2是β-catenin的上游调控分子。本研究结果显示，LOXL2的表达水平骨肉瘤组织明显高于骨软骨瘤组织，且骨肉瘤组织中LOXL2与β-catenin的表达呈正相关，提示LOXL2与β-catenin可能在骨肉瘤的发病过程中存在调控的关系。进一步分析可知，随着肿瘤体积增大、Enneking分期增加、远处转移的发生，骨肉瘤组织中LOXL2的表达水平明显增加。在此基础上通过细胞实验进行验证，在转染siRNA敲低骨肉瘤组织中LOXL2的表达后，组织中β-catenin的表达水平降低，同时细胞增殖及侵袭均受到抑制，提示LOXL2在骨肉瘤组织中对β-catenin具有调控作用，也对骨肉瘤细胞的增殖和侵袭具有调控作用。

3.2 骨肉瘤组织中β-catenin、LOXL2表达与远期预后的关系骨肉瘤病理特征的恶化及肿瘤细胞异常的增殖和侵袭是远期生存期缩短的重要影响因素。研究[19]显示,肿瘤体积、远处转移是骨肉瘤患者预后的影响因素。另有一项研究[3]表明，β-catenin的高表达是骨肉瘤预后的影响因素。另外，学者们[20-22]发现，肾癌、食管癌、乳腺癌中β-catenin是预后的影响因素。但目前国内缺少β-catenin与骨肉瘤预后关系的临床证据。本研究采用Kaplan-Meier曲线分析了不同β-catenin、LOXL2表达水平与骨肉瘤患者总生存率的关系，结果发现β-catenin、LOXL2的高表达会造成总生存率降低，说明β-catenin、LOXL2在骨肉瘤的预后中发挥作用。

综上所述，骨肉瘤组织中β-catenin、LOXL2表达增加，与病理进展、预后不良有关；LOXL2在骨肉瘤组织中可能靶向调控β-catenin。