基于厌氧氨氧化菌特性的富集策略及培养过程分析

蒙小俊，朱 妮

（安康学院旅游与资源环境学院，陕西安康 725000）

化肥的过度使用、工业和生活废水处理不达标、牲畜废水排放不当等均会导致过多氮素进入水体，造成水体富营养化，生态失衡并危害人体健康〔1〕。有效处理含氮废水不仅可以改善环境，对可持续发展也有非常重要的意义〔2〕。污水处理设施在废水脱氮中发挥关键作用，但主流传统硝化反硝化曝气能耗大，需补充外源有机物并产生大量污泥，增加了污水运营成本，出水水质也难以满足严格的排放标准要求〔3〕，寻求更经济高效的脱氮途径成为目前污水处理面临的挑战。

厌氧氨氧化（Anammox）反应为污水脱氮带来革命性变革。该反应是厌氧氨氧化菌（AAOB）以NO2−为电子受体，将NH4+氧化为N2的自养脱氮过程。相比于传统脱氮过程，Anammox 过程能降低50%的曝气量、100%的有机碳源、90%的运行费用，释放更少的温室气体，污泥产率低，且具有更少的空间需求〔4〕，成为迄今为止最简捷的污水生物脱氮途径。近年来以Anammox 技术为核心的脱氮工艺得到快速发展，如单级短程硝化-厌氧氨氧化工艺（SNAP）、全程自养脱氮工艺（CANON）、短程硝化−厌氧氨氧化（Sharon-Anammox）工艺、短程反硝化−厌氧氨氧化工艺（PD/A）、短程硝化−厌氧氨氧化−反硝化工艺（SNAD）、短程硝化−厌氧氨氧化−短程反硝化工艺（SPNAPD）等。世界范围内已建成200 余座Anam⁃mox 工程，用于处理市政污泥液、半导体生产废水、制革生产废水、垃圾渗滤液和污泥消化液等。此外，Anammox 工程在新加坡樟宜回用水处理厂和西安市第四污水处理厂主流工艺中实现了稳定运行。

尽管Anammox 脱氮具有技术优势，但AAOB 生长速率低、倍增时间长，工程应用面临障碍。基于AAOB 特性的富集培养一直是Anammox 研究领域关注的焦点〔5〕。笔者对近年来Anammox 的相关研究进行梳理和分析，总结了AAOB 的生物特性、富集策略和培养过程，并对该领域未来的研究方向进行展望，以期为Anammox 工程应用提供一定支持。

1 AAOB 的生物特性

1.1 AAOB 分布与种类

AAOB 属于细菌，存在于自然生境及生物反应器、污水处理厂等人工环境中，在全球氮循环中起到重要作用。约50%释放到大气中的N2与AAOB 有关〔6〕。据最新报道AAOB 共有6 属27 种〔7〕，6 属分别为Ca. Anammoxoglobus（2 种）、Ca. Brocadia（6 种）、Ca. Anammoximicrobium（1 种）、Ca. Kuenenia（1 种）、Ca. Scalindua（14 种）和Ca. Jettenia（3 种）。Ca. Kue⁃nenia、Ca. Anammoxoglobus、Ca. Brocadia和Ca. Jette⁃nia多在生物反应器中发现，Ca. Scalindua主要存在于海洋和一些低氧自然环境，Ca. Anammoximicro⁃bium于河底泥中发现。自然环境中发生种内和种间竞争，AAOB 占据不同的生态位〔8〕，致使不同生境中AAOB 的种类和丰度不同。研究表明，农业土壤生 境 中 以Ca. Brocadia（72.3%）和Ca. Kuenenia（22.8%）为主；而海洋生境中Ca.Scalindua占绝对主导地位，达到98.4%；河口是陆地淡水与海水的混合区域，存在Ca. Kuenenia、Ca. Brocadia和Ca. Scalin⁃dua，但以Ca. Scalindua（68.7%）为主；湿地作为与淡水、海洋和土壤都相关的复合生态系统，其AAOB 特征与河口相似〔9〕。AAOB 在不同环境中的群落结构组成和丰度受碳氮比、有机物、温度、盐浓度及无机氮等的影响。其中盐度是影响AAOB 物种组成差异分布的最主要因素，从河流生态到红树林生态，随盐度的增加，AAOB 优势种属由Ca. Brocadia转变为Ca. Scalindua〔10〕。AAOB 在 人 工 环 境 中 同 样 因 生 态位的不同而发生转移。在实验室反应器中经常观察到不同AAOB 种之间的种群转移，如废水处理过程当盐度增加到160 mmoL/L 时，主要功能菌由Ca.Kuenenia转 变 为UnclassifiedCa. Brocadiaceae〔11〕。AAOB 的环境分布具有多样性，随生态位差异的深入研究将有更多新种被鉴定。

1.2 AAOB 生理生化特性

严格厌氧的AAOB 可生存温度范围在−2.5~100 ℃，但多嗜中温，最适生长温度为30~40 ℃，最佳生长pH 为6.7~8.3，倍增时间在10~30 d〔12〕。根据生长动力学，可将AAOB 类群分为“快生型”和“慢生型”，前者具有较高的比生长速率，基质亲和力相对较弱，后者具有较强的基质亲和力，比生长速率较低。几乎在所有条件下Ca. Brocadiasp. 40 最有可能胜过其他淡水AAOB；高NO2−条件下（如废水处理），Ca. Brocadia sinica成为Ca. Brocadiasp. 40 的良好竞争者，表明两种Brocadia都适用于废水处理〔8〕。AAOB 对变化的环境条件高度敏感，极难培养，聚集生长形成颗粒是AAOB 的本性。异质Anammox 颗粒可自主聚集成大颗粒，有效避免缓慢生长的AAOB 被冲洗掉，增加生物量浓度，提高对不利环境的耐受性并增强工艺稳定性，以便保持较高的去除NH4+−N 和NO2−−N 的活性〔13−15〕。如图1 所示，鲜红色是AAOB 最显著的特征〔16〕，其色度与生物活性显著相关。色度与血红素c 浓度之间的相关性与完全还原的细胞色素c 一致，且通过细胞色素c 的含量和氧化还原比进行确定〔17〕。

图1 AAOB 富集培养物表观性状Fig.1 Apparent properties of AAOB enrichment cultures

AAOB 能以CO2为唯一碳源，固碳途径为乙酰辅酶A 途径，所需还原力由醌氧还酶或氢醌提供，所需能量由亚硝酸氧化为硝酸过程提供〔18〕。部分AAOB可以氧化乙酸、丙酸等有机物，但不能用其合成细胞物质，如利用丙酸和乙酸可分别富集Ca.Anammoxo⁃globus propionicus和Ca. Brocadia fulgida〔19−20〕，Ca.Brocadia和Ca. Kuenenia有编码挥发性脂肪酸代谢的基因〔21〕。AAOB 代谢底物具有多样性，可以Fe3+、Mn4+、NO、SO42−等为电子受体氧化NH4+；也可利用Fe0、Fe2+、小分子有机酸等电子供体还原NO2−/NO3−。AAOB 参 与 氮 循 环 可 能 存 在3 条 途 径〔12〕：途 径1 ，NO2−−N 被 还 原 为NH2OH，之 后 与NH4+−N 结 合 生 成N2H4，最后N2H4被氧化生成N2；途径2，NO2−−N 被还原为NO，与NH4+−N 反应生成N2H4，最后被氧化生成N2；途径3，NO 直接作为电子受体结合NH4+−N 生成N2H4，随后被氧化生成N2；上述过程需要羟胺氧化还原酶（HAO）、亚硝酸盐还原酶（NIR）、亚硝酸氧化还原酶（NXR）、联氨合成酶（HZS）和联氨氧化还原酶（HZO）的参与。N2H4是AAOB 氮循环的中间代谢产物，HZS/HZO 基因常作为AAOB 的分子标识。

接种AAOB 富集物是在规模化污水处理厂中建立Anammox 并实现快速脱氮的有效方法〔22〕。基于AAOB 的生物特性，可通过不同策略对菌株进行富集培养，如工艺调控、聚集造粒（颗粒污泥和生物膜污泥）、物质强化（Fe3+、Mn4+、超声、电磁波、氧化石墨烯、赤霉素和谷氨酸钠等）、环境控制（基质浓度、碳氮比、盐度、重金属和硫化物等）、菌株保藏、菌株固定化、菌株驯化和菌株回收等。高效的富集培养可以缩短反应启动时间并提高脱氮效率，对于提高AAOB 工程应用至关重要。笔者对工艺调控、聚集造粒和菌株保藏策略进行着重阐述。

2 AAOB 富集策略

2.1 工艺调控

污泥龄（SRT）、DO 和水力停留时间（HRT）等参数及反应器的类型、结构可改变AAOB 富集过程中菌群的群落结构，从而影响AAOB 的数量、种类和活性。SRT 可决定污泥中微生物的种类，应控制SRT大于AAOB 的倍增时间，在菌种富集培养过程中尽可能少排泥或不排泥。AAOB 严格厌氧，富集培养中需严格控制DO 浓度，低于2%的O2饱和浓度对AAOB 的抑制为可逆抑制，但Anammox 反应过程中NO2−−N 浓度常不稳定，需结合短程硝化（PN）和短程反硝化（PD），为满足AAOB 富集，SNAP 和PD/A应控制O2分别在0.2~0.4 mg/L 和<0.1 mg/L〔7〕。调节NO2−−N 和DO 可以促进AAOB 的 富 集，在77 d 内 实现规模化Anammox 工艺的启动〔23〕。缩短HRT 是快速富集AAOB 并提高脱氮效率的另一有效途径。有研究表明，缩短HRT 时菌株EPS 中的蛋白质（PN）/多糖（PS）由1.35 升至1.86，稳定达到2.08，有效促进污泥颗粒化，总氮去除负荷（NRR）平均达到0.58 kg/（m3·d），总 氮 去 除 率（NRE）均 值 维 持 在94.2%，脱氮性能保持稳定〔24〕。因反应器、接种污泥和工艺的不同，HRT 由十几分钟到几小时不等〔25〕。HRT 会影响水力负荷、水力剪切力和上升流速等，HRT 越短水力负荷增大，水力剪切力强度增大，容易导致污泥冲洗〔26〕，AAOB 富集培养时应根据实际情况设置HRT。抗水力负荷冲击能力以膜生物反应器（MBR）最强，序批式反应器（SBR）次之，膨胀颗粒污泥床（EGSB）最弱；抗基质浓度冲击能力以MBR 最强，EGSB 次之，SBR 最弱。

AAOB 生长缓慢，生物量约为0.11 g/g（以每单位质量NH4+−N 污泥中可挥发性固体计），导致污泥形成缓慢，在不利条件下易流失〔13〕，难以实现菌株富集。具备高效生物截留能力的反应器对于AAOB的富集必不可缺。升流式厌氧污泥床反应器（UASB）、SBR、EGSB、MBR、厌 氧 折 流 板 反 应 器（ABR）、上流式膜生物滤池（UBF）和序批式生物膜反应器（SBBR）等均为AAOB 富集过程常用的反应器，其优缺点对比情况如表1 所示〔27〕。

表1 常用AAOB 富集反应器的优缺点Table 1 Advantages and disadvantages of commonly used AAOB enrichment reactors

反应器的类型与富集污泥形态有很大关系。Anammox 污泥富集培养可分为絮体污泥、颗粒污泥和生物膜污泥〔28〕，上述反应器中富集颗粒污泥时可选用UASB、EGSB、ABR 和UBF，富集絮体污泥可采用SBR、MBR，生物膜污泥可选择SBBR。根据污泥培养的需求，接种同种污泥至不同反应器可以获取不同形态的污泥富集物，如分别接种絮状硝化污泥于MBR、ABR中，2 种反应器均能成功启动Anammox，但反应器中污泥的形态差异明显：MBR 中的污泥呈絮状，ABR 隔室中以颗粒污泥为主〔29〕。传质效果不佳、污泥流失和混合不均匀等是诸多反应器共同存在的问题，为满足AAOB富集需对反应器进行改进。在反应器内设搅拌装置、增设悬浮填料和外设回流装置等可有效解决上述弊端〔30〕。王恒等〔31〕用内设搅拌装置对UASB 进行改进，成功启动时主要AAOB 由Ca. Kuenenia转化为Ca.Brocadia，NRR 为0.520 kg/（m3·d）。此外，一些新型反应器如复合式生物膜−活性污泥反应器（IFAS）、移动床生物膜反应器（MBBR）和厌氧膜生物反应器（AMBR）等在AAOB 富集过程中也得到不断应用。高效的Anammox 反应器应满足以下要求：（1）截留生物量能力强；（2）泥水混合均匀；（3）传质效果好；（4）运行稳定且经济；（5）严格厌氧、避光。反应器的选择应考虑水质、处理程度和环境条件。如水量少、水质多变、水质排放要求不高，可选择SBR；若水质排放要求较高则选择MBR，但应注意膜堵塞问题。

2.2 聚集造粒

Anammox 工艺的应用和工业化受AAOB 生长特性的限制。为保证有效的生物量富集，污泥颗粒化是最可接受的策略之一。颗粒污泥是微生物自固定过程产生的微生物聚集体，其主要成分为细菌及微生物产生的胞外聚合物（EPS）〔32〕，EPS 在黏附厌氧细菌或厌氧微颗粒的过程中起重要作用。与其他形式的活性污泥相比，AAOB 的EPS 具有较高的PN/PS，大量的疏水基团和较松散的蛋白质二级结构，使AAOB 具有较强的聚集能力〔15〕。接种颗粒污泥或生物膜污泥均能形成Anammox 颗粒污泥〔33〕。

杨金虹等〔34〕的研究结果表明，随着颗粒污泥粒径的增加，EPS 中的PS 含量基本不变，PN 由54.43 mg/g 增 至137.40 mg/g，PN/PS 由6.63 提 高 到7.71；EPS 中PN 的比例与粒径之间为正相关关系，对污泥颗粒的形成起到主要作用。郭萌蕾等〔35〕研究认为，影响AAOB 颗粒化形成的因素有金属离子、有机物、盐度、温度、pH 和信号分子等，适量的有机物可促进颗粒污泥的形成，适量投加Ca2+、Mg2+和Fe3+后，颗粒污泥的外形紧凑、结构光滑，而高盐度会抑制AAOB 的活性与生长，降低颗粒污泥的强度和粒径。在AAOB 颗粒化过程中，高氮负荷率（NLR）下会自发发生颗粒污泥的漂浮，特别是在UASB 中，污泥漂浮会导致生物质被冲走，甚至导致AAOB 生物反应器脱氮失败。AAOB 颗粒内部的空化是颗粒漂浮的关键原因，可将颗粒漂浮划分为3个区域，分别为无漂浮区（无漂浮发生）、过渡区（有一部分颗粒漂浮）和漂浮区（不可避免地发生漂浮）。漂浮行为主要受过渡区颗粒直径（2.5~4.5 mm）和底物浓度（NO2−−N 50~250 mg/L）的影响，避免漂浮但具有良好沉降性能的最佳颗粒直径约为2.5 mm，颗粒尺寸比底物浓度更为敏感〔36〕。若颗粒污泥富集培养过程中出现漂浮现象，可添加高丝氨酸内酯类（AHLs）信号分子，提高AAOB 颗粒污泥的活性和生长速率，有效解决其在高负荷反应器中的漂浮问题〔37〕。

富集的AAOB 颗粒性质取决于形成颗粒的操作条件或生物反应器。从粒径、颜色、形状等角度考虑，同一反应器内没有2 个相同的颗粒，颗粒之间存在异质性〔14〕。同一反应器中AAOB颗粒之间的尺寸存在差异，Ca.Brocadia和Ca.Kuenenia以大颗粒（>0.4 mm）为主，而Ca.Jettenia以中小颗粒污泥（<0.4 mm）为主〔38〕。粒径较大时微生物多样性更高，且支持更多功能，粒径增加能显著提高AAOB颗粒的比活性（SAA）和耐受性，粒径>4.75 mm 的颗粒的SAA 最高为426.8 mg/（g·d），但也给传质带来不利影响〔39〕。为保证传质并提高AAOB颗粒的SAA 和耐受性，应对操作条件进行控制（如提高水力剪切力），在一定水力剪切力条件下，污泥粒径最终达到动态平衡。富集良好的AAOB 颗粒污泥细胞密度高、脱氮效率高，并能承受极端环境。Chongjian TANG 等〔40〕在实验室条件下用AAOB 颗粒污泥在UASB中实现74.3~76.7 kg/（m3·d）的氮负荷；颗粒污泥可适应的温度和pH 范围分别为5~45°C、5.68~9.26，均超过AAOB 的适宜生长条件〔32〕。

向生物反应器内投加载体形成生物膜污泥是AAOB聚集造粒的另一形式。载体为AAOB 提供附着繁衍的场所，促进AAOB 的富集生长，减少菌体流失并抵御不利环境的影响。MBBR 中的生物填料可使Anammox 反应在10 ℃的低温环境中顺利进行〔41〕，而在MBR 中投加填料可提高AAOB 的相对丰度，为其提供更加稳定的生长环境并显著减轻膜污染〔42〕。载体的选择至关重要，无纺布、生物炭、海绵、沸石、零价铁、聚乙二醇凝胶和活性炭等是常用的富集培养AAOB 生物膜污泥的载体〔43〕。这些载体大多比表面积大、阻力小、空隙率高、表面粗糙度大、亲水，且价廉易得、化学稳定性高。然而填料的材质、类型和结构对AAOB生物膜量、活性、脱氮性能和微生物群落结构有重要影响。王钧等〔44〕的研究表明，取聚乙烯（T1）和聚氨酯（T2）2 种悬浮填料投入到2套相同的厌氧序批式生物膜反应器（ASBBR）R1 和R2 中，反应器分别在第93、73 天成功启动，稳定运行至150 d 时，单个T1、T2 填料的AAOB 活性分别为5.70、3.70 mg/（g·h），T1、T2 填料中Ca.Anammoxoglobus属的相对丰度分别为75.29%、38.23%，T1 填料更适于AAOB 的富集。王淑雅等〔45〕采用低温等离子体技术对普通聚氨酯泡沫塑料填料进行表面改性处理，改性后填料表面的粗糙度增加，亲水性能明显改善，相同时间内单位质量填料处的生物膜量较改性前提高了53%，微生物种类丰富程度更高，HZO 相对丰度由59.50%增至73.50%。尽管Anammox 生物膜污泥和颗粒污泥均有助于污泥的富集持留，但相比于颗粒污泥，等质量的生物膜表现出较差的抵抗有机物冲击的能力〔46〕，有机负荷高的废水采用生物膜处理工艺时应结合其他工艺除碳。在目前的工程中实现Anammox，生物膜反应器较活性污泥法具有明显优势。AAOB 附于载体时的生长活性比悬浮培养时的高，较常采用的是MBBR。MBBR存在特定的生物膜分层结构，而分层结构是抑制NOB的重要条件，可实现原池改进，提高处理负荷、强化处理效果，且耐低温。西安市第四污水处理厂提标改造工艺采用A2/O+MBBR，在10~20 ℃水温下成功实现Anammox 启动并长期稳定运行，有效填补了常温生产应用的空白。

2.3 菌株保藏

AAOB 细胞产率低，对富集成功的AAOB 污泥进行储存并在短期内使其活性快速恢复，成为Anammox工艺启动和运行中行之有效的策略〔47〕。适于AAOB保存的技术有冷藏保存、冷冻干燥和保护剂等〔48−49〕。冷冻干燥过程中对细胞有不可逆转的破坏，因此其成功率不如冷藏保存〔50〕，而冷藏保存容易引起微生物结构变化，长期保存后会导致遗传物质改变〔49〕。在保护剂的作用下，若冷藏保存的时间适宜则可快速恢复菌株活性，富集AAOB 并提高其丰度。AAOB 保存的最优温度为4 °C，在此条件下保存2 周的污泥（无底物和保护剂）可保留93%的SAA〔51〕，冷藏保存已成为具有发展前景的快速启动Anammox 过程的技术之一。M. ALI 等〔52〕在4 °C 下用NH4+、NO2−、NO3−和钼酸盐作为保护剂保藏Ca. Brocadia sinica45 d，可保留23%~88% 的 SAA；Quan ZHANG 等〔48〕利 用 以Ca.Kuenenia为主产生的EPS 作为保护剂，保藏AAOB污泥90 d，可保留33.4%的SAA，而反硝化污泥EPS 为保护剂时SAA 为27.8%。

保藏过程中AAOB 的消耗会导致细胞萎缩，污泥沉降性变差，保藏时间一定程度上与活性负相关。合适的保护剂可减少保藏期间菌群活性的丧失，可用二甲亚砜、海藻糖、甘油、葡萄糖、聚乙烯醇和海藻酸钠等作为保护剂〔53〕。简便有效的复苏方法对恢复AAOB 活性及提高其丰度起到积极作用，温度应控制在30~40 ℃，底物基质应控制在100 mg/L以下，质量浓度之比在1.32左右，可选择使用ASBR 和UASB 等〔54〕。

3 AAOB 的富集培养过程

从接种污泥开始，Anammox 脱氮启动过程依据氮素去除规律可分为活性迟滞、活性提高及稳定运行3 个阶段。该过程实质是采用适宜AAOB 富集的培养条件驯化接种污泥，淘汰劣势菌，微生物群落均匀度逐渐变差，AAOB 菌群的相对丰度不断提高，形成相对单一、稳定的生物群落，主要显著特征为氮素负荷逐渐提高，微生物多样性逐渐降低，AAOB 丰度逐渐提高，污泥颜色逐渐变为鲜红色。在活性迟滞阶段，接种污泥未能适应新的环境而发生细胞自溶，释放一定量的NH4+−N，出水NH4+−N高于进水NH4+−N，这是Anammox 启动中活性迟滞阶段的一个显著特征。细胞自溶的同时产生有机物，可作为NO2−−N 的电子供体，系统表现出一定程度的反硝化作用，出水NO2−−N 浓 度 始 终 低 于 进 水NO2−−N 浓度。随着启动时间的延长，细胞自溶现象逐渐减弱，出水NH4+−N 浓度接近进水NH4+−N 浓度。活性迟滞阶段的长短与接种污泥的性质有很大关系，不同污泥源条件下Anammox 启动过程与运行特性的比较见表2〔55〕。

表2 不同污泥源时AAOB 的富集与培养过程Table 2 Enrichment and cultivation process of AAOB with different sludge sources

在活性提高阶段，AAOB 得到一定富集逐渐成为优势菌株，反硝化和细胞自溶过程逐渐被Anammox 反应所取代，出水中的NH4+−N 和NO2−−N 均呈下降趋势，而出水NO3−−N 有所升高，这主要是Anammox 反应产生NO3−−N 所致，NO3−−N 产生量可视为Anammox 反应的重要标志。在稳定运行阶段，氮素负荷不断提高并最终稳定，生物多样性进一步降低，以AAOB 为主的菌株成为优势菌，污泥颜色红色增强。

AAOB 细胞产率低且对环境敏感，富集培养过程应依据AAOB 的特性对各种不利影响（温度、pH、DO、基质浓度、SRT、盐度、醇酸和金属离子等）进行严控。对于实际废水尤其是工业废水，因其化学成分复杂、氮浓度较高，极易影响AAOB 的生长代谢和富集，应更加高度重视。污水处理过程中若富集培养出现失稳，可采用原位清洗和降低系统NLR，系统可迅速恢复〔24〕；当NO2−−N 抑制相对较轻时，通过降低进水基质浓度，反应器的性能可快速恢复，当抑制相对较重时，恢复程度降低〔56〕。失稳后的AAOB对游离氨和游离亚硝酸的耐受能力明显降低，对DO的敏感度增加〔57〕，恢复时系统的氮浓度和DO 宜低于正常运行时的浓度，并适当延长HRT。添加AHLs 信 号 分 子 和 低 浓 度N2H4可促进菌株活性〔37〕，失稳条件下可考虑利用。Anammox 脱氮失稳恢复依据氮素去除规律，同样经历活性迟滞、活性提高及稳定运行3 个阶段。

4 结论与展望

以AAOB 为驱动的Anammox 途径为污水脱氮带来革命性的变革。而AAOB 的生长速率低、倍增时间长、对环境敏感成为工程应用的瓶颈，如何高效富集培养AAOB 成为关键。笔者从AAOB 生理生化特性、富集培养策略和富集培养过程3 个方面阐述了菌株的富集培养。但由于AAOB 在环境中的分布具有多样性，其生理生化差异导致生态位分化，富集培养时应依据不同菌株的特性多手段协同，同时充分考虑污水水质和环境条件。此外，有些问题仍有待深入探究：（1）不同生境条件下AAOB 生物特性分析；（2）不同AAOB 菌株富集培养的多手段协同；（3）水质成分和环境条件对AAOB 富集影响的耦合机制。