下调miR-3613-5p通过靶向FRMD6调控肾癌细胞增殖和细胞周期

曾光 胡晓晖 杨超 崔应东 杜然

肾癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率均较高[1-2]。肾癌患者预后差的关键因素是肾癌细胞的恶性生长[3-4]。靶向肾癌细胞增殖的研究是近年来临床治疗肾癌和改善肾癌患者预后的重要研究方向。肾癌发病的本质是肾小管上皮细胞内抑癌基因的失活和癌基因的异常高表达从而诱导细胞的恶性生长[5]。目前的研究显示，微小RNA(miRNA)是参与调控肾癌发生和发展的重要调控因子[6]。He等[7]研究显示，肺腺癌标本中miR-3613-5p表达显著上调，与肺腺癌患者的不良预后相关，miR-3613-5p在体内和体外均能够显著促进肺腺癌细胞的增殖。然而，有关miR-3613-5p在肾癌细胞增殖中的作用机制并未见文献报道。本研究旨在分析miR-3613-5p表达水平与肾癌患者预后的相关性，探讨miR-3613-5p调控肾癌细胞增殖和细胞周期的分子机制，以期为肾癌的临床靶向治疗提供新的治疗策略。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人肾癌细胞株A498、Caki-1、OS-RC-2、ACHN以及正常肾小管上皮细胞HK-2均购自中国典型培养物保藏中心。培养液和胎牛血清(FBS)均购自美国Thermo Scientific HyClone公司。miR-3613-5p mimics(5′-UGUUGUACUUUUUUUUUUGUU-C-3′)、miR-3613-5p 抑制物(5′-GAACAAAA-AAAAAAGUACAACA-3′)、miR-NC mimics和阴性对照质粒(si-miR-Con)均购自上海捷瑞生物科技有限公司。Trizol试剂盒和LipofectamineTM2000试剂均购自美国Invitrogen公司。蛋白提取试剂盒购自美国Bio-Rad公司。CCK-8试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天公司。一抗p-AKT1、p-MAPK3、CCND1、β-Tubulin、含FERM结构域蛋白6(FERM domain-containing protein 6， FRMD6)均购自美国BD公司。FRMD6野生型载体(psi-CHECK-2-FRMD6-WT)质粒、FRMD6突变型载体(psi-CHECK-2-FRMD6-MUT)质粒均购自美国Promega公司。辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

二、细胞培养和转染

将A498、Caki-1、OS-RC-2、ACHN细胞置于含10% FBS的RPMI-1640培养液中，将HK-2细胞置于含10% FBS的DMEM培养液中，在37 ℃、5% CO2条件下常规培养。将Caki-1细胞培养在6孔板至汇合度为40%时，将100 nmol/L的miR-3613-5p 抑制物和si-miR-Con分别用LipofectamineTM2000转染至Caki-1细胞，分为si-miR-3613-5p组和si-miR-Con组。在37 ℃、5% CO2条件下常规培养3 d。

三、miR-3613-5p表达预后分析及靶基因预测

采用OncoLnc预后分析数据库分析miR-3613-5p表达水平与肾癌患者生存率的关系。采用miRTarBase在线预测软件预测miR-3613-5p的靶基因。

四、qPCR检测miR-3613-5p和FRMD6 mRNA的表达水平

用Trizol试剂盒提取肾癌细胞株中总RNA，用一步法逆转录合成cDNA。qPCR引物序列如下：18s rRNA上游：ATTCCGATAACGAACGAGA-C，下游：TCACAGACCTGTTATTGCTC；GAPDH上游：AGCCACATCGCTCAGACAC，下游：GCCCAATACGACCAAATCC；miR-3613-5p上游：CTTGTTTTTTTTTTCATGTTGT，下游：AGTC-TCAGGGTCCGAGGTATTC；FRMD6上游：CTTCCCAACGATGAATCTCTGAA，下游：GGC-AGTCCTTTAGCCTGAGC。建立qPCR循环体系，miR-3613-5p以18s rRNA为内参，FRMD6 mRNA以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt计算相对表达量。

五、CCK-8法检测Caki-1细胞的增殖

细胞转染1、2、3、4、5 d后，分别将si-miR-3613-5p组和si-miR-Con组Caki-1细胞密度调整为4×104个/ml，取200 μl细胞悬液接种至96孔板。每孔加入30 μl CCK-8试剂，于恒温培养箱内孵育3.5 h，采用酶标仪检测每孔在波长490 nm处的吸光度(A)值。A值与Caki-1细胞数量成正比，以此作为检测Caki-1细胞增殖活力的指标。

六、流式细胞术检测Caki-1细胞的细胞周期

离心收集si-miR-3613-5p组和si-miR-Con组的Caki-1细胞，以2 ml的预冷磷酸盐缓冲液重悬细胞，重复洗涤3次，以磷酸盐缓冲液重悬细胞，加入预冷的70%乙醇溶液，在冰箱内固定12 h。离心去乙醇，以2 ml的预冷磷酸盐缓冲液重复洗涤3次。加入600 μl的PI染液，重悬细胞，在冰箱内孵育45 min，用流式细胞仪分析各组细胞的周期分布。

七、双荧光素酶报告基因实验验证miR-3613-5p和FRMD6的靶向关系

采用LipofectamineTM2000将FRMD6野生型载体、FRMD6突变型载体与miR-NC或miR-3613-5p mimics共转入Caki-1细胞。采用裂解液裂解细胞，分别检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，以两者的比值验证miR-3613-5p和FRMD6的靶向关系。

八、Western blotting检测FRMD6蛋白和AKT/MAPK信号通路蛋白表达

离心收集si-miR-3613-5p组和si-miR-Con组的Caki-1细胞，提取总蛋白并检测蛋白的浓度。每组取40 μg蛋白进行SDS-PAGE胶电泳和硝酸纤维素膜转膜，在9%的脱脂牛奶中封闭，加入一抗(1∶2 000)，在4 ℃冰箱内过夜后洗去多余一抗，以1∶5 000稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温孵育3.5 h。洗去多余二抗，加入化学发光液，在发光系统中曝光并显影。

九、统计学方法

使用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计分析，正态分布的计量数据以均数±标准差表示，两组间均值差异比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、miR-3613-5p表达与肾癌患者预后的关系

预后分析结果显示，miR-3613-5p表达水平较低的肾癌患者生存率显著高于miR-3613-5p表达水平较高的肾癌患者(P<0.01)，见图1。

图1 miR-3613-5p表达水平与肾癌患者生存率的关系

二、miR-3613-5p在肾癌细胞株中的表达

qPCR法检测结果显示(图2)，肾癌A498、Caki-1、OS-RC-2、ACHN细胞株中miR-3613-5p表达水平显著高于HK-2细胞(t=3.25、t=7.82、t=4.93、t=7.08，均P<0.05)，且Caki-1细胞中miR-3613-5p表达水平明显高于A498、OS-RC-2、ACHN细胞(P<0.01)。

注：与HK-2相比，*P<0.05，**P<0.01图2 miR-3613-5p在肾癌细胞株中的表达水平

三、miR-3613-5p 抑制物的干扰效率

si-miR-Con组和si-miR-3613-5p组Caki-1细胞中miR-3613-5p的表达水平分别为(11.02 ± 1.72)和(1.03 ± 0.47)，si-miR-Con组的表达水平显著高于si-miR-3613-5p组(P<0.01)。

四、低表达miR-3613-5p对Caki-1细胞增殖的影响

CCK-8法检测结果显示(图3)，与si-miR-Con组相比，低表达miR-3613-5p组从第2天开始显著抑制Caki-1细胞增殖(P<0.05)。

注：与si-miR-Con组相比，*P<0.05，**P<0.01图3 CCK-8法检测两组Caki-1细胞的增殖能力

五、低表达miR-3613-5p对肾癌Caki-1细胞周期的影响

流式细胞术检测结果显示(图4)，si-miR-3613-5p组处于G0～G1期的细胞数高于si-miR-Con组(P<0.01)，处于S期的细胞数低于si-miR-Con组(P<0.01)，处于G2～M期的细胞数低于si-miR-Con组(P<0.05)，表明敲除miR-3613-5p可使Caki-1细胞阻滞于G0～G1期，进而抑制Caki-1细胞的增殖能力。

注：与si-miR-Con组相比，*P<0.05，**P<0.01图4 流式细胞术检测两组Caki-1细胞的细胞周期分布

六、FRMD6是miR-3613-5p的靶基因

miRTarBase在线预测软件预测结果显示(图5)，FRMD6可能是miR-3613-5p的靶基因。如图6所示，共转染FRMD6野生型载体/miR-3613-5p mimics的Caki-1细胞中荧光素酶活性显著低于miR-NC(P<0.01)，共转染FRMD6突变型载体/miR-3613-5p mimics的Caki-1细胞中荧光素酶活性与miR-NC比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图5 miR-3613-5p与FRMD6 mRNA的互补配对结合序列

注：与miR-NC相比，**P<0.01图6 双荧光素酶报告基因实验验证FRMD6是miR-3613-5p的靶基因

七、两组Caki-1细胞中FRMD6 mRNA的表达

si-miR-Con组和si-miR-3613-5p组Caki-1细胞中FRMD6 mRNA的表达水平分别为(1.05±0.46)和(6.91±1.48)，转染miR-3613-5p 抑制物的Caki-1细胞中FRMD6 mRNA表达水平显著上调(P<0.01)。

八、FRMD6蛋白和AKT/MAPK信号通路蛋白表达

如图7所示，与si-miR-Con组相比，si-miR-3613-5p组Caki-1细胞中FRMD6蛋白表达水平显著上调，AKT/MAPK信号通路蛋白p-AKT1、p-MAPK3、CCND1表达明显降低。

图7 Western blotting检测两组细胞中FRMD6蛋白及AKT/MAPK信号通路蛋白的表达

讨 论

大量研究表明，miRNA能够显著调控原癌基因或抑癌基因的表达，影响肾癌细胞的恶性生物学行为[8-10]。miRNA的异常激活或表达缺失，可能会干扰或促进肾癌的发生和发展[11-13]。例如，miR-1246在肾癌组织和细胞株中下调，过表达miRNA-1246减弱了肾癌786-O和769-P细胞的增殖和迁移能力[14]。肾癌组织和细胞株中miR-133b呈低表达，miR-133b通过抑制ERK信号通路影响肾细胞癌的细胞增殖、侵袭和化学敏感性[15]。miR-3613-5p作为原癌基因，促进肺腺癌细胞在体内和体外的增殖[7]。本研究通过OncoLnc预后分析数据库分析显示，miR-3613-5p表达水平较低的肾癌患者的生存率显著高于miR-3613-5p表达水平较高的肾癌患者，提示miR-3613-5p高表达与肾癌患者的不良预后相关。同时，qPCR结果显示miR-3613-5p在肾癌细胞株中高表达，低表达miR-3613-5p能够抑制肾癌Caki-1细胞的增殖和细胞周期，证实miR-3613-5p是一种原癌基因，与以往研究结果相同。

miRNA主要通过与目标基因mRNA的非翻译区不完全配对结合，导致其mRNA降解，从而下调目标基因的表达[16-18]。miRNA通过调控目标基因的表达，影响肾癌细胞的增殖、细胞周期、凋亡、铁死亡等过程[19]。本研究采用miRTarBase在线预测软件预测显示，FRMD6是miR-3613-5p的靶基因。FRMD6在调控细胞生长、细胞周期及凋亡方面发挥着重要作用[20]。有研究发现，FRMD6基因在前列腺癌细胞中异常高甲基化，过表达FRMD6能够抑制前列腺癌细胞的活力、细胞周期、集落形成能力等，表现为肿瘤抑制作用[21]。同时，也有研究证实FRMD6在胶质母细胞瘤中低表达，显著抑制胶质母细胞瘤的生长和进展[20]。此外，FRMD6受到miRNA的调控，如miR-454-3p靶向FRMD6促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭[22]。本研究证实在肾癌细胞中，FRMD6是miR-3613-5p的靶基因，且miR-3613-5p能够负调控FRMD6基因的表达。AKT/MAPK信号通路激活与肾癌细胞的淋巴结转移、增殖、分化程度等显著相关，干扰AKT/MAPK信号通路转导明显抑制肾癌细胞的恶性增殖[23]。本研究结果显示，低表达miR-3613-5p促进FRMD6基因表达后，AKT/MAPK信号通路蛋白p-AKT1、p-MAPK3、CCND1表达明显降低。

综上所述，miR-3613-5p高表达与肾癌患者的预后不良相关；抑制miR-3613-5p表达后，FRMD6的表达水平显著上调，并可降低AKT/MAPK信号通路活性，进而抑制肾癌Caki-1细胞增殖和细胞周期。miR-3613-5p/FRMD6分子轴可能成为新的肾癌分子治疗靶点。