微生物发酵联用折光仪检测糖蜜含糖量的研究

周培华，刘 兰，钟文涛，杨 滔，周兴旺，袁列江

（湖南省产商品质量检验研究院，食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南长沙 410017）

糖蜜是制糖过程中，糖液经浓缩析出结晶糖后残留的棕褐色黏稠液体。在我国的微生物发酵工业尚不成熟前，曾一直被当作制糖业的废弃物，给环境造成了较为严重的污染。糖蜜的成分复杂，其最主要的营养成分是糖，含糖量在40%～80%，多为聚合度不等的多元糖和一定数量的单糖，此外还含有较丰富的维生素、植物蛋白氨基酸、果胶等[1-2]。

如今，糖蜜的废物利用已形成较为完善的工业加工体系，作为一种重要的食品工业发酵原料进入市场，并被广泛应用于酿酒酵母、面包酵母发酵生产乙醇、丁醇、氨基酸多肽、虾青素和单细胞蛋白饲料等食品发酵相关行业[3-7]。由于其营养较丰富且价格相对廉价，因此糖蜜作为食品工业原料常呈现供不应求的状态。据统计，2021年国内全年糖蜜生产交易量为3863万t，此外还有进口糖蜜1209万t， 价格从2015年的800元/t左右逐年上升，截止到2021年 9月平均价格为1100元/t[8]。

目前，在糖蜜市场的交易中用以衡量糖蜜品质的核心指标是其含糖量的多少。由于糖蜜交易极为频繁，因此要求检测过程快速、高效。但常规的含糖量检测周期太长，且由于糖蜜中的糖分多为混合糖类，聚合单元繁杂，不太适合使用常规的含糖量检测方法，因此目前在糖蜜交易过程中依然采用最简单、粗放的折光仪检测[9]。折光仪的本质是检测可溶性固形物含量，只适用于成分较为单一的糖液含糖量检测评判，而糖蜜中的其他多种物质对固形物含量都有影响，因此采用折光仪检测含糖量偏差非常大。一些不规范的糖厂及中间商在糖蜜中加入非糖类的可溶性固形物，以次充好，极大地扰乱了糖蜜市场，对下游的食品发酵工业领域造成较大的经济损失和工艺负担。此外，食品发酵企业为了对发酵生产进行工艺设计和计算，需准确测量糖蜜的含糖量。目前，在以糖蜜为原料进行生产高附加值产品的企业大都采用生物酶总糖检测试剂盒，该试剂盒采用进口酶制剂将聚合度不同的糖水解为葡萄糖，再用紫外吸光光度法检测葡萄糖进而得到糖蜜的含糖量。该方法检测成本较高，生产企业一般无法承受对来源不同、批次不一的糖蜜进行频繁检测，因此只能进行代表性地抽检，给发酵工业和工艺带来了很多不确定性，给生产和品质造成了很大影响。个别实验室依然采用传统的硫酸蒽酮法检测糖蜜含糖量，但是此方法的本质是检测总碳水化合物，在检测糖蜜这种含有果胶成分的混合物时会出现较大偏差，且使用浓硫酸碳化样本，全程需要在沸水和冰冻环境中切换操作，不仅危险而且极为 烦琐[10]。

针对目前尚没有一种高效、准确的糖蜜含糖量检测方法，本文通过对糖蜜含糖量检测的分析和研究，采用微生物发酵和折光仪联用的方法检测糖蜜的含糖量，准确且高效，以期规范糖蜜的品质衡量指标，改变目前糖蜜市场的混乱局面，也为以糖蜜为原料的发酵生产企业降低检测成本提供方法和思路，从而保证相关工艺优化和产品品质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母（高糖）（广西丹宝利酵母有限公司）；嗜渗酵母CICC32788（中国工业微生物菌种保藏管理中心）；PDA琼脂培养基、BHI脑心肉汤培养基、葡萄糖（北京陆桥）；多糖检测试剂盒（德国拜发EnzyTECtm）；糖蜜（市购样品）；VINASE干 粉（市购）。

1.2 仪器与设备

PAL-1/2折光仪（日本ATAGO）；SPS401F电子天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]；MIR-154-PC恒温培养箱（日本Panasonic）；T9紫外可见光分光光度计（北京普析）；101-3AB干燥箱（天津泰斯特）；5804R台式高速冷冻离心机（德国EPPENDORF）；HWS-28水浴锅（上海一恒）；C-MAGHS7加热磁力搅拌器（德国IKA）。

1.3 方法

1.3.1 葡萄糖标准溶液配制

取适量葡萄糖，于100 ℃±2 ℃减压干燥箱内烘至恒重。

葡萄糖标准储备液：精密称取烘干后的葡萄糖100.00 mg，置于10 mL容量瓶中，用纯水溶解并稀释至10 mL，摇匀，制成浓度为10.00 mg/mL的标准贮备液，4 ℃保存。

葡萄糖标准工作液：分别准确量取10.00 mg/mL的标准储备液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、 6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL至10 mL容量瓶并定容至10 mL，浓度依次为1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL、 4.0 mg/mL、5.0 mg/mL、6.0 mg/mL、8.0 mg/mL和 10.0 mg/mL，临用新配。

1.3.2 菌株活化菌悬液制作

将酿酒酵母干粉0.0100 g使用无菌水10.0 mL溶解后划线至PDA平板，挑取较大单菌落接种至BHI肉汤，36 ℃培养24 h，8000 r/min离心5 min去除上清液，加入30%（W/W）灭菌甘油溶液混匀，分装并冻存。临用时常温解冻，8000 r/min离心2 min去除上清液，加入灭菌生理盐水摇匀备用。

1.3.3 糖蜜前处理

称取糖蜜原液5 g，加入纯水45 mL稀释摇匀，5000 r/min离心2 min除泥，留取上清液S作为糖蜜待检样。

1.3.4 试剂盒检测糖蜜含糖量

取德国拜发EnzyTECtm多糖检测试剂盒，每 5 mL待测样品加入5 mL酶解液，65 ℃酶解6 h；加入着色试剂0.2 mL，85 ℃着色30 min，于505 nm处检测吸光值，根据葡萄糖标准曲线方程计算糖蜜含糖量。

1.3.5 微生物发酵联用折光仪检测糖蜜含糖量

分别选取市售酿酒酵母干粉和嗜渗酵母标准菌株，活化后制作成即用型菌悬液；糖蜜10倍稀释待测液，各取2管等量5 mL分别加入10 mL离心管，分别标记为S0和S1，分别加入5 mL菌悬液，其中S0加入菌悬液后立即煮沸灭活，S1加入菌悬液，36 ℃ 培养2 h后，分别离心取上清液，折光仪检测锤度，分别得到锤度S0、S1，两者之差可换算得出糖蜜中的含糖量。同时采用德国拜发含糖量试剂盒检测糖蜜含量，用以分析比较两种方法检测含糖量的准确度。

1.3.6 对比分析统计计算方法

微生物发酵联用折光仪检测糖蜜含糖量的计算公式如下：

式中：S0为空白的糖锤度值，Bx；S1为酵母发酵后的糖锤度值，Bx；V为稀释倍数；m为样品取样量，g。

多糖检测试剂盒紫外可见光光度计含糖量的计算公式如下：

式中：axOD为测定曲线斜率；b为测定曲线截距：V为稀释倍数；m为取样量，g。

两种方法含糖量检测值偏差的计算公式如下：

1.3.7 微生物发酵联用折光仪检测糖蜜加标回收及干扰实验检测

（1）葡萄糖加标回收。每份糖蜜待测样品取3份，各取10 mL，其中2份分别加入葡萄糖0.5 g、2.0 g，1份作为本底对照实验组，溶解完全后采用微生物发酵联用折光仪检测其回收率。

（2）干扰实验。每份糖蜜待测样品取3份，各取10 mL，其中2份分别加入酵母发酵废液干粉（VINASE干粉）0.5 g、2.0 g，1份作为本底对照实验组，溶解完全后采用微生物发酵联用折光仪检测含糖量。考察添加非糖类可溶性固形物对该方法检测糖蜜含糖量的干扰。

2 结果与分析

2.1 试剂盒法检测葡萄糖标液绘制标准曲线

试剂盒法检测葡萄糖标液的标准曲线见图1。

图1 试剂盒法检测葡萄糖标液绘制标准曲线

2.2 微生物发酵联用折光仪法与试剂盒检测糖蜜含糖实验结果

通过对12个糖蜜样品分别采用酿酒酵母发酵、嗜渗酵母联用折光仪和多糖检测试剂盒法检测结果的分析比较，以酿酒酵母作为发酵菌株实验组，偏差范围在-7.70%～2.32%，平均绝对偏差为2.28%。

以嗜渗酵母作为发酵菌株实验组，偏差范围在-1.50%～2.00%，平均绝对偏差为0.46%，嗜渗酵母联用折光仪检测含糖量结果非常接近多糖检测试剂盒法的检测结果，详见图2。

图2 微生物发酵联用折光仪法与试剂盒检测结果

2.3 微生物发酵联用折光仪法加标回收及抗干扰实验结果

2.3.1 葡萄糖加标回收实验结果

采用嗜渗酵母法作为发酵菌株，每份糖蜜待测样品取3份，各取10 mL，其中2份分别加入葡萄糖0.5 g、2.0 g，1份作为本底对照实验组，溶解完全后采用折光仪检测其回收率，检测结果见表1。葡萄糖回收实验组中，加入量0.5 g实验组回收率在84.0%～106.0%，平均回收率高达90.8%；加入量 2.0 g实验组回收率在94.8%～105.2%，平均回收率高达100.5%。

表1 葡萄糖加标回收实验结果

2.3.2 非糖可溶性固形物对新建方法的干扰实验

采用嗜渗酵母法作为发酵菌株，每份糖蜜待测样品取3份，各取10 mL，其中2份分别加入酵母发酵废液干粉（市售VINASE干粉）0.5 g、2.0 g，1份作为本底对照实验组，溶解完全后采用折光仪检测含糖量，考察添加非糖类可溶性固形物对该方法检测糖蜜含糖量的干扰，结果见表2。非糖可溶性固形物实验组中，加入量0.5 g实验组偏差在-2.4%～1.1%，平均绝对偏差仅为0.4%；加入量2.0 g实验组偏差在-3.5%～1.7%，平均绝对偏差仅为-1.1%。由实验数据可知，非糖固形物粉状的加入对于微生物发酵联用折光仪检测糖蜜的稳定性无影响。

表2 非糖可溶性固形物对嗜渗酵母发酵联用折光仪检测糖蜜含糖量影响的实验结果

3 结论与讨论

传统多糖检测试剂盒检测法的核心是使用微生物提取和纯化一系列糖苷水解酶，将糖蜜中聚合度复杂的多聚糖水解成单糖，再利用着色剂显色，于505 nm处检测吸光度从而检测其含糖量。本文研究初期选定酵母系列，正是基于该系列微生物的糖苷酶极为丰富，可水解消耗糖蜜中的多聚合度糖，最终产物是乙醇和二氧化碳，在加热过程中挥发，在空白对照折光度扣除消耗组的折光度后即可得到糖蜜中的含糖量。

先以多糖检测试剂盒检测结果为对照值，微生物发酵联用折光仪使用菌株同时考察酿酒酵母和嗜渗酵母，检测糖蜜含糖量，两种菌株的检测结果均较理想，但嗜渗酵母实验组偏差范围更小，平均绝对偏差仅为0.46%，可能是由于嗜渗酵母抗逆性效果更好，在组分较为复杂的糖蜜样品中更能稳定地发挥其糖苷酶活性，故最终选定嗜渗酵母CICC32788作为该方法的发酵菌株。

通过葡萄糖添加实验考察新建立方法的准确度，在低糖加标实验中的平均回收高达90.8%，在高糖加标实验中更是高达100.5%，充分说明该方法的准确性较好；通过添加VINASE干粉（市售非糖性可溶性固形物）至糖蜜样本，采用微生物发酵联用折光仪检测样本的含糖量，检测新建方法的抗干扰能力。结果显示，偏差值均小于2.0%，平均绝对偏差均小于0.5%，说明该方法的抗干扰能力较强，能解决目前糖蜜交易市场中普遍存在的不规范添加固形物的问题，有效杜绝糖蜜交易过程中以次充好的现象。

此外，新建方法的检测时间大幅缩短，不需要漫长的酶解时间、标准曲线制作、OD值检测时间，且只用到折光仪这类简单仪器。

综上所述，微生物发酵联用折光仪法是一种低成本、低门槛、高效率的糖蜜含糖量检测方法，具有优异的准确性、稳定性，可被广泛应用于糖蜜生产、交易、加工行业。