从废旧报纸中分离高产纤维素酶菌种的鉴定和研究

曹哲，闫雅清滢，于静怡，吴玲艳，路婉婷，于欣悦，徐佳璐，郑苗苗

从废旧报纸中分离高产纤维素酶菌种的鉴定和研究

曹哲1，闫雅清滢1，于静怡1，吴玲艳1，路婉婷1，于欣悦1，徐佳璐2，郑苗苗1

（1. 哈尔滨学院 食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150001；2. 哈尔滨医科大学 口腔医学院，黑龙江 哈尔滨 150001）

目前，造纸行业是对森林资源消耗最大的产业，每年用于造纸消耗的木材数量巨大．以预处理的废报纸浆为原料，在一定条件下筛选产纤维素酶菌株，应用于废纸纸浆脱墨研究，考察了浓度、时间、温度对废报纸中分离高产纤维素酶菌种的影响，并采用简单染色、革兰氏染色和刚果平板法进行菌株鉴定．结果表明，以报纸为唯一营养源，进行摇床培养，从培养液中分离纯化出一株短杆状具有芽孢的革兰氏阳性菌．以羧甲基纤维素钠为唯一碳源，最终筛选出具有高产能力的产纤维素酶菌株，命名为QQ1128.1．提取16S rDNA，经PCR扩增和序列测序后，构建系统发育树，鉴定细菌QQ1128.1为芽孢杆菌属的一个新种．获得的脱墨菌种能够提高再生资源的有效利用，实现国家生态文明建设．

纤维素酶；16S rDNA；筛选；鉴定

随着科技飞速发展，纤维素酶在食品、医药、纺织、造纸和能源等工业中得到了广泛应用[1]．目前，我国林木资源匮乏，并且面临着“植树不见树、造林难成林”的问题，而纸张的主要成分来源于林木资源．我国纸浆消耗量居亚洲首位，导致纸浆进口依赖很大[2]257．当今废旧报纸、书、杂志等废纸浪费严重，因此，回收利用废纸对林木资源的紧张有一定的缓解，而且可以减少对国外纸浆的进口量．

废纸脱墨是回收废纸不可或缺的一部分，一般的对废纸进行脱墨的方法会用到化学方法，但是这种方法要用到大量的化学物质，如NaOH、Na2SiO3、Na2CO3、H2O2、螯合剂、表面活性剂等，对环境造成污染．除此之外还有洗涤脱墨、浮选脱墨、蒸汽爆破、溶剂脱墨和生物酶脱墨等方法．对废纸脱墨时用生物酶法不仅可以提高废纸的脱墨作用和效果，还可以削减化学药品对环境的破坏．现在对废纸进行脱墨的探究和钻研主要是对脂肪酶、漆酶、纤维素酶等，通常是把纤维素酶和其他酶结合起来进行应用[2]258．虽然国内外对纤维素酶用于脱墨进行了广泛大量的研究[3]，但很少有直接以报纸为唯一营养源进行培养并从报纸培养液里分离筛选可以产生纤维素酶细菌，然后将筛选出的菌株用于对废纸进行脱墨的研究中．菌种筛选和培育主要有2种方法[4-6]：一是以得到有更高的产纤维素酶能力的菌株为目的，从可以分解纤维素的菌源中筛选分离出所需要的菌株；二是用诱变育种法，获得可以产生纤维素酶并且具有高产能力的菌株．随着DNA体外重组技术的不断完善和进步，国内外已经有大量科研工作者将DNA体外重组技术用于改造或创造出具有高产纤维素酶能力的菌株中．

本研究拟从以报纸为唯一营养源的报纸培养液中筛选出一株可以产生纤维素酶并且具有高产能力的菌株，并鉴定筛选出的菌株，该实验为具有高产纤维素酶能力的菌株对废纸进行脱墨提供一定的研究依据．目前实验已完成菌株的分离，并将获得的新型脱墨菌株——枯草芽孢杆菌保存于中国微生物菌种保藏中心．已经完成产品迭代并制作出复合生物菌剂，且已经得到良好反馈．

1　材料与方法

1.1　仪器与材料

显微镜（苏州南光电子科技有限公司）；恒温恒湿箱（上海平轩科学仪器有限公司）；电子天平（常州市幸运电子设备有限公司）；电热恒温水浴锅（上海鑫翁科学仪器有限公司）；微波炉（琪摩电子科技有限公司）；多功能电磁炉（深圳市龙华新区智首电器厂）；台式离心机（盐城市凯特实验仪器有限公司）；净化工作台（郑州南北仪器设备有限公司）；高压蒸汽灭菌器（济南展康医疗器械有限公司）；振荡培养箱（济南铭晟医疗器械有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海慧泰仪器制造有限公司）；冰箱（松下电器（中国）有限公司）；PCR仪（BIO RAD，伯乐生命医学产品（上海）有限公司）；稳压稳流电泳仪（上海启闵生物科技有限公司）；紫外透射分析仪（上虞艾科仪器设备有限公司）．

无水乙醇（开封百川汇宝实业有限公司）；羧甲基纤维素钠（河北鹏与生物科技有限公司）；Tris，溶菌酶（Biotopped，北京博奥拓科技有限公司）；乙二胺四乙酸二钠（牡丹江市丰达化工进出口有限责任公司）；刚果红（湖北欣欣佳丽生物科技有限公司）；胰蛋白胨（上海振品化工有限公司）；酵母膏（武汉恩比德化工产品有限公司）；Agar（BIOSHARP，北京兰杰柯科技有限公司）；氢氧化钠（沧州刘氏化工有限公司）；硫酸镁（山东腾飞生物科技有限公司）；磷酸二氢钾（柳州市新纳精细化工厂）；丙三醇（沈阳久野化工原料有限公司）；硝酸铵（昆明鹿阜商贸有限公司）；冰醋酸（山东旭晨化工科技有限公司）；溴化乙锭（Sigma，江苏西格玛电器有限公司）．

以废旧报纸为唯一碳源进行摇床培养的培养液．

1.2　方法

1.2.1培养基（1）LB固体培养基．胰蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，NaCl 5 g，琼脂粉7.5 g，d H2O 500 mL，pH7.0．（2）LB液体培养基．胰蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，NaCl 5 g，d H2O 500 mL，pH7.0．（3）筛选培养基[7]．羧甲基纤维素钠（CMC-Na）7.5 g，NH4NO30.5 g，酵母膏0.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，K2HPO40.5 g，琼脂粉10 g，d H2O 500 mL，pH自然．

1.2.2初筛在三角瓶中倒入200 mL蒸馏水和20个玻璃珠，再放入0.3 g报纸剪成的碎纸片．把三角瓶放置于37 ℃、180 r/min的摇床培养48 h．继续进行10倍梯度稀释，吸取0.1 mL稀释样液在LB固体培养基平板上涂布，将每个浓度梯度的平板密封做好记号后于37 ℃的恒温恒湿培养箱里培养1～2 d．选择单个菌落进行染色（简单染色[8]、革兰氏染色和芽孢染色[9]）观察，将分离纯化出的菌株接到LB液体培养基中进行培养，准备用于复筛实验．

1.2.3复筛只有能够把纤维素水解成单糖，并且可以利用水解纤维素生成产物的细菌才可以在以CMC-Na为唯一碳源的刚果红培养基上生长[10-12]，利用筛选培养基筛选分离出能够产生纤维素酶并且具有高产能力的菌株．将配置好的每200 mL CMC-Na培养基分装到三角瓶中，封口灭菌．称0.05 g刚果红用于配制10 mg/mL的刚果红溶液，取1 mL的刚果红溶液加到200 mL的培养基中．震荡摇匀后倒平板．取待测菌接种于LB液体培养基摇床培养活化，吸取菌液涂布后，倒置37 ℃恒温箱中进行培养，观察菌落外部形态特征及在培养基上产生透明圈的大小．将复筛得到的菌株接种到LB液体培养基，于37 ℃，180 r/min的摇床培养8～10 h，液体LB培养基变浑浊．将1 mL的菌液和1 mL浓度为50%灭菌后的甘油移入2 mL离心管中并震荡，充分混合溶液．最后甘油的浓度为25%，把甘油与菌液混合均匀后放入-20 ℃冰箱进行菌种保藏[13]，为筛选得到的菌株进行分子生物学鉴定做准备．

1.3　鉴定

1.3.1形态学鉴定在细菌生长的平板上观察菌落的特点（如颜色、外形、表面是否光滑等[14]）；简单染色观察细菌的形态；革兰氏染色鉴定筛选的菌株为G+还是G-；芽孢染色看到细菌可以产生芽孢．并和初筛的染色结果对比，确定复筛得到的菌株是从以报纸为唯一营养源的报纸培养液中分离筛选出的菌株并进行初步的鉴定．

1.3.2分子生物学鉴定（1）细菌基因组16S rDNA的提取[15]．在超净工作台中用移液枪吸取保藏菌液800 μL，移入装有100 mL LB液体培养基的三角瓶中，放到温度设置为37 ℃转数180 r/min的摇床里一直到液体中能够看到浑浊．把细菌的16S rDNA用DNA提取试剂盒（离心柱型）提取出来．试剂盒产品组成为：缓冲液GA 15 mL，缓冲液GB 15 mL，缓冲液GD 13 mL，漂洗液PW 15 mL，洗脱缓冲液TE 15 mL，ProteinaseK 1 mL，吸附柱CB 350个，收集管（2 mL）50个．离心管中得到的溶液即为提取到的细菌16S rDNA．将得到细菌的16S rDNA放到-20 ℃的冰箱储存．

（2）0.8%琼脂糖凝胶电泳检测[16-17]．DNA在电泳液中经过电场中的凝胶介质移向正极，DNA片段不一样在单位时间内泳动的距离也不一样．

①配制50*TAE缓冲液．称Tris 2.42 g，乙二胺四乙酸二钠0.372 g，加入8 mL蒸馏水搅拌均匀后加入0.571 mL冰乙酸，搅拌均匀后倒入蒸馏水至10 mL．在配好的50*TAE中倒入490 mL蒸馏水，稀释为500 mL的1*TAE缓冲液后，放置一旁待需要时使用．

②配40 mL 0.8%的琼脂糖凝胶．拿一个250 mL三角瓶，用分析天平称0.32 g琼脂糖，称量40 mL的1*TAE倒在三角瓶里，再把称好的琼脂糖倒进去，混匀后用封口膜封上，放入微波炉中加热，使溶液变成透明．

③制备胶板．在电泳槽一侧插好梳子，等琼脂糖凝胶液冷却到用手摸不烫时加入1 μL 0.5 mg/mL的EB混合均匀后，慢慢地把胶液倒在制胶槽中，静置，等胶液变成固体可以看到乳白色后，把胶上的梳子轻轻地直着拿下来．把凝胶和胶板按正确的方向放进电泳槽里并卡住胶板，在电泳槽中倒入1*TAE缓冲液直到没过胶板．

④上样．用移液枪吸取2份2 μL的溴酚蓝，分别与5 μL Marker和DNA样品在点样板上混合均匀后，用移液枪按顺序移到点样孔中，每加完一个样品要更换枪头．

⑤电泳．把电泳槽上的线接好，打开电泳仪，电压调到90～100 V，当蓝色条带移到距离点样孔2 cm时，关闭电泳仪的电源．

⑥观察．取出胶板放到紫外透射分析仪观察后，放在成像系统观察并拍照记录．

（3）PCR扩增．PCR[18]后可以得到指数倍的模板DNA片段，很快就可以获得很多的特定的基因片段．提取细菌的16S rDNA片段用作模板．PCR反应体系（25 μL）：引物1 1 μL，引物2 1 μL，DNA模板1 μL，缓冲液、4种dNTP溶液、taqDNA聚合酶、Mg2+等混合液12.5 μL，ddH2O 9.5 μL．PCR反应条件：95 ℃下预变性5 min，95 ℃变性10 s，49 ℃退火10 s，72 ℃下延伸1 min，共来回32次，最后在72 ℃下延伸5 min，到温度下降到12 ℃时反应结束．取5 μL PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，剩下的PCR产物放到冰箱4 ℃保藏．检测后取出胶板放到紫外透射分析仪观察，并放在成像系统观察且拍照记录，检测结果满意后在哈尔滨市擎科嘉美生物科技有限公司对扩增产物测序．

（4）菌株16S rDNA序列分析与菌株鉴定．把DNA序列粘贴到NCBI数据库，经过Blast得到与该细菌基因序列同源性较高的序列，建立该菌株的系统发育树[19-20]，鉴定筛选分离出的菌株．

2　结果与分析

2.1　菌株初筛结果分析

在三角瓶中倒入200 mL蒸馏水，放入20个玻璃珠后，将报纸剪成细小的碎片，并称取0.3 g放到三角瓶中（见图1a），把三角瓶放到37 ℃、180 r/min的摇床培养24 h后（见图1b），培养48 h后（见图1c），观察效果．由图1b～c可见，培养48 h后的培养液颜色明显比培养24 h后的培养液颜色变浅．由此可以得出，以报纸为唯一碳源的培养液中存在具有脱墨作用的微生物．

图1　报纸纸浆不同培养时间效果

取报纸培养液稀释，涂布到LB固体培养基长出不同形态菌落（见图2a），选择一个长得好的单菌落，把它用接种环挑出来一点，然后在LB固体培养基平板上划线，培养后得到的细菌在LB固体培养基上生长情况（见图2b）．

图2 报纸培养液中分离脱墨细菌生长形态

用接种环挑取图2b中的单个菌落进行染色（见图3）．由图3可见，筛选出的为短杆状菌体，革兰氏染色把菌体染为紫色（见图3b），说明该菌为G+，芽孢染色后看到芽孢被染成绿色，菌体被染成红色（见图3c），说明筛选出的细菌能够产生芽孢．

图3　不同染色方法的初筛效果

2.2　菌株复筛结果分析

吸取初筛的菌株保藏的菌液，移入LB液体培养基摇床培养活化后，用移液枪吸取菌液滴到以CMC-Na为唯一碳源的刚果红培养基上涂布后，倒着放到培养箱里培养，细菌生长结果见图4．筛选出的菌株可以在以CMC-Na为唯一碳源的刚果红培养基平板上生长并能产生透明圈，说明这个细菌是能够产纤维素酶并且具有高产能力的菌株．

2.3　菌株的鉴定

2.3.1菌株的形态学鉴定选择复筛平板上生长的一个单菌落，用接种环挑一点细菌放到LB液体培养基中，然后放到37 ℃、180 r/min的摇床里培养，等三角瓶中的液体能看到混浊后，取菌液涂布在LB固体培养基平板上．放到37 ℃的恒温恒湿培养箱培养12 h后，可以看到菌落的外沿呈现出乳白色，中间为粉红色，菌落表面比较粗糙（见图5）．

图4　菌株复筛结果

图5　复筛培养12 h菌落

对待鉴定的菌落进行染色（见图6），并放到显微镜下观察，在低倍镜下找到视野后再调换到油镜观察．

图6　不同染色方法的复筛效果

通过染色观察比较，鉴定的菌株与初筛的菌株是一样的，菌体全为短杆状，用革兰氏染色法染色后，菌体呈紫色（见图6b），表明这个菌为G+，芽孢染色观察到芽孢为绿色，菌体为红色（见图6c），说明该菌产芽孢，暂且将此菌株命名为QQ1128.1．

2.3.2菌株的分子生物学鉴定将提取的细菌16Sr DNA进行琼脂糖凝胶电泳后，放到电子成像系统下观察，电泳结果见图7．

把QQ1128.1的DNA作为模板进行PCR扩增，电泳检测PCR产物，观察电泳结果，得到的DNA片段长度约1 500 bp（见图8）．

图7　细菌16S rDNA琼脂糖凝胶电泳电子成像

注：1. Maker DL2000；2. QQ1128.1的16Sr DNA．

图8　电泳检测QQ1128.1的DNA作为模板进行PCR扩增产物

注：1. Maker DL2000；2. CK；3. QQ1128.1的16Sr DNA的PCR扩增产物．

在哈尔滨市擎科嘉美生物科技有限公司对PCR产物测序后，测得PCR扩增产物条带长度为1 049 bp，核苷酸序列为：GGGCGTCGTGCTATACTGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGTGGTTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGGCCTGGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGGGGGAAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACTCCTCTGACATCCCTAAAGATAGGACGTCCCTTTCGGGGCAAAATGACAGGGGGTTCATGGTTGTCCCCACTTCGGGCC．

图9　BioEdit软件打开序列

将序列用BioEdit软件打开（见图9），由图9可见，序列无双峰和底峰，说明所用引物和模板较纯．

2.3.3构建系统发育树把DNA序列粘贴到NCBI数据库中，经过Blast得到QQ1128.1基因组序列（见图10），发现QQ1128.1与枯草芽孢杆菌同源性最高，达98.43%．

图10　Blast得到QQ1128.1基因组序列

选择5个和QQ1128.1最可能是从共同祖先经过进化后成为不同序列的菌株，下载这5个菌株的序列，用clustal X软件对序列进行比较后，用MEGA 4软件建系统发育树（见图11），鉴定QQ1128.1为芽孢杆菌属的一个新种．

图11　MEGA 4软件建系统发育树

3　结论

以报纸为唯一营养源的培养液中存在具有脱墨作用的微生物，从培养液中经过初筛和复筛得到一株产纤维素酶的高产菌株并命名为QQ1128.1．通过对该菌的形态学鉴定和分子生物学鉴定并构建系统发育树，鉴定QQ1128.1为芽孢杆菌属的一个新种．

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Identification and study of high cellulase producing strains isolated from waste newspapers

CAO Zhe1，YAN Yaqingying1，YU Jingyi1，WU Lingyan1，LU Wanting1，YU Xinyue1，XU Jialu2，ZHENG Miaomiao1

（1. School of Food Engineering，Harbin Institute，Harbin 150001，China；2. School of Dentistry，Harbin Medical University，Harbin 150001，China）

Currently，the paper industry is the industry that consumes the largest amount of forest resources，and the amount of wood consumed for paper making is huge every year．Pretreated waste newspaper pulp was used as raw material to screen cellulase producing strains under certain conditions and applied to the study of deinking of waste paper pulp．The effects of concentration，time and temperature on the isolation of high cellulase producing strains from waste newspaper were investigated，and the strains were identified by simple staining，Gram staining and Congo plate method．The results showed that a short rod-shaped Gram-positive strain with budding spores was isolated and purified from the culture solution by shaking bed culture using newspaper as the only nutrient source．Using sodium carboxymethyl cellulose as the sole carbon source，a cellulase producing strain with high capacity was finally screened and named QQ1128.1．16S rDNA was extracted，and after PCR amplification and sequence sequencing，a phylogenetic tree was constructed to identify the bacterium QQ1128.1 as a new species of the．The deinked strain obtained can improve the effective use of renewable resources，realize the construction of national ecological civilization．

cellulase；16S rDNA；screening；identification

1007-9831（2022）08-0063-08

Q55

A

10.3969/j.issn.1007-9831.2022.08.013

2022-04-18

黑龙江省大学生创新创业训练计划项目（202210234018）；哈尔滨学院青年博士科研启动基金项目（HUDF2019103）；黑龙江省博士后资助经费项目（LBH-Z18028）

曹哲（2000-），男，山西大同人，在读本科生．E-mail：1491514846@qq.com

郑苗苗（1982-），女，黑龙江哈尔滨人，教授，博土，从事应用微生物研究．E-mail：miaomiao_0000@126.com