天麻新品系“略麻-1号”选育及质量评价△

王海峰，李晓东，付玉平，黄钦，李明，董林林，陈士林

1.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；2.大理大学 药学院，云南 大理 671000；3.略阳县中药材技术推广服务中心，陕西 汉中 724300

天麻Gastrodia elataBl.是异养兰科植物，无根、无绿色叶片，须与蜜环菌伴生[1]。其以干燥块茎入药，具有极高的营养价值和显著的药理活性[2]。现代研究表明，天麻主要含有天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷、多糖、氨基酸等有效成分[3-4]，具有抗氧化[5]、抗抑郁[6-7]、抗衰老[8]、抗炎[9-11]、抗癫痫、抗惊厥[12-14]、镇痛镇静[15-16]等药理作用。2019 年11 月25日，国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局联合下发了《关于对党参等9 种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知》，为天麻食品开发提供了政策依据。

随着市场需求不断增大，野生天麻被过度采挖，导致其野生种质资源日益匮乏，甚至濒临灭绝，人工栽培已成为天麻的主要来源[17]。在集中栽培、异地栽培等过程中，天麻种群变异和退化问题严重，导致产量和品质下降，严重制约天麻产业的可持续发展[18]。其栽培过程中易遭受杂菌感染或腐烂病等危害，导致表皮溃烂、生长受阻、产量降低和品质变劣[19]。因此，选育抗病强、繁殖力强、退化弱、高产优质的新品种是保障天麻产业健康可持续发展的重要举措。

陕西省略阳县是我国天麻传统道地产区之一，全县地存天麻10 000亩（1亩≈666.67 m2）500万窝，年可产麻种2000 t，商品干天麻超过1000 t。2006年以来，“略阳天麻”先后通过国家食品药品监督管理局《中药材生产质量管理规范》（以下简称GAP）认证和国家地理标志保护产品认证，已成为当地的特色支柱产业，在脱贫攻坚和乡村振兴工作中发挥了重要作用。但是，该地区也面临栽培品种退化和优质天麻新品种匮乏的问题，本课题组利用略阳县丰富的天麻种质资源优势，经过多年的系统选育，培育出红天麻“略麻-1 号”（ZYXP-2020-006），并在陕西、湖北等地进行推广。本研究以“略麻-1号”和安徽红天麻为研究对象，通过对“略麻-1 号”性状、产量、有效成分进行系统分析，为优质天麻生产提供数据参考。

1 材料

1.1 样品

野生天麻（RYB-1）、蜜环菌（Am-23-4）、萌发菌（GSF-8104）均由陕西汉王略阳中药科技有限公司提供。“略麻-1 号”和安徽红天麻均为质量200～250 g、无病虫害、体型完整、顶芽饱满完整的箭麻。“略麻-1 号”、安徽红天麻及RYB-1 经中国中医科学院中药研究所赵庆贺副研究员鉴定为红天麻Gastrodia elataBI.f.elata。

1.2 仪器

ME203E/02 型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；5425R 型离心机（德国Eppendorf）；B-220 型恒温水浴锅、RE-2000 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KQ5200V 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DGG-9070B 型电热恒温鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）；FW200 型高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）；Arc 高效液相色谱系统（美国Waters公司）。

1.3 试药

对照品天麻素（批号：M11GB148059，纯度＞98%）、对羟基苯甲醇（批号：R09D8X50333，纯度≥98%）均购于上海源叶生物技术有限公司；D（+）-无水葡萄糖对照品（批号：1122A0231，纯度≥98%）、牛血清白蛋白（BSA，批号：809A052，纯度≥96%）、考马斯亮蓝G-250 溶液均购于北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、浓硫酸、85%磷酸均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；乙腈［色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；甲醇（色谱纯，北京化工厂）；水为屈臣氏纯净水。

2 方法

2.1 选育过程

RYB-1 采挖于略阳县白水江镇的林地（E106°01′14″，N33°26′25″，海拔1 267.26 m），通过人工有性繁殖，对RYB-1 进行自交选育，获得“略麻-1号”种茎（图1）。选育过程中淘汰箭麻质量＜100 g、抽薹生育期＜50 d、每穗蒴果直径＜30 cm 的天麻繁殖材料，将后代性状不一致的材料按选育标准进行淘汰，将符合目标性状的箭麻再进行自交，将2 代箭麻按目标进行选育，获得3 代自交选育的稳定红杆品种，将此品种进行田间试验，观察其性状、生物学特性、病虫害发生情况，并检测产量、天麻素等药用成分含量。选育过程中种植地均为砂壤，pH 为6.8，年均降雨量为850 mm，大田栽培，夏季遮阳，田间种植按中药材GAP进行常规管理。

图1 “略麻-1号”选育流程

2.2 品种测试

按中华人民共和国农业行业标准《植物品种特异性、一致性和稳定性测试指南天麻》（NY/T 2593—2014）[20]规定进行，测试周期为箭麻开始萌动，经过抽薹、开花到成熟的生长过程。在室内进行以筐栽人工授粉方式种植，温度为20～25 ℃，相对湿度为60%～80%。选取与测试品种接近的品种作为对照品种，根据“略麻-1号”形态特性选择近似品种安徽红天麻作为对照。选育品种及对照组每个品种均种植60个。

2.3 田间试验

以五龙洞镇中川坝（N33°30′40.19″、E106°51′13.07″，海拔1000 m，土壤pH 6.7，砂壤土）为实验点，进行天麻大田栽培试验。3 月初室内育种，开展品种测试，5月大田栽培。大田栽培步骤：1）先做畦，畦宽约0.7 m，长度依据地形规划，按上下2层共10根棒为1窝（约0.5 m2）标准（每窝天麻蒴果10 个，600 mL 蜜环菌和萌发菌瓶各1 瓶，栎类青冈树10根，直径6 cm，长50 cm，有鱼鳞口，大小比较均一）；2）拌种，将萌发菌与天麻种子轻轻搅拌均匀；3）播种，将拌好的含天麻种子的萌发菌叶均匀地撒在铺满湿树叶的畦底，再将5 根树棒均匀放上，间距4～6 cm，在树棒两侧与鱼鳞口处均匀摆放蜜环菌数节，覆盖湿砂土，同样方法种植第2 层，最后将砂土填成龟背状，按照中药材GAP 进行常规管理。选育品种与对照品种每20 m2小区作为1个重复，每个品种3 个重复。种植150 d 后，每个小区随机选取3 窝观察种茎生长状况。17个月后随机选取3窝统计折干率、有效成分含量及产量，将收集到的新鲜天麻样品分别洗净、烘干、趁鲜切薄片，放入电热鼓风干燥箱（45 ℃）干燥，将烘干的样品用高速万能粉碎机打成粗粉（过三号筛）备用。

2.4 样品检测

2.4.1 样品处理及折干率测定方法 按参考文献[21]测定天麻折干率，将采挖鲜天麻洗净，晾干表面水分，测定鲜质量，蒸至透心，放冷后置55 ℃电热鼓风干燥箱烘至4～5成干，取出，回潮12 h，继续干燥、回潮重复多次至恒重，按公式（1）计算折干率。

2.4.2 天麻素和对羟基苯甲醇含量测定 按《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版天麻项下高效液相色谱法测定天麻素和对羟基苯甲醇的总量[22]。

2.4.3 多糖含量测定 按参考文献[23]苯酚-硫酸法测定天麻多糖含量，标准溶液制备及标准曲线绘制：精密称取D（+）-无水葡萄糖对照品10 mg（105 ℃干燥至恒重），加入蒸馏水，制成0.1 mg·mL-1葡萄糖标准液。分别精密吸取葡萄糖标准液0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mL于试管中，加蒸馏水至2.0 mL，加入5%苯酚1 mL，摇匀后加浓硫酸5 mL，摇匀，蒸馏水定容，于40 ℃水浴保温10 min，冷却至室温后测定490 nm 处吸光度值，以标准液质量浓度（mg·mL-1）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

取天麻样品粉末1.00 g，加入80%乙醇25 mL，60 ℃浸泡2 次，每次30 min，滤过，低温烘干，加入去离子水200 mL，50 ℃超声提取40 min，得天麻多糖提取液。将天麻多糖提取液2 mL 稀释5 倍，吸取0.2 mL 于试管中加蒸馏水至2 mL，按标准曲线绘制方法，测定490 nm吸光度值。

2.4.4 蛋白质含量测定 按参考文献[24]考马斯亮蓝染色法测定天麻蛋白质含量。标准溶液制备及标准曲线绘制：取BSA 100 μL 加入PBS 缓冲液2.4 mL中，稀释至终质量浓度为0.2 mg·mL-1。准备6 支干净试管，编号。分别吸取0、100、200、300、400、500µL BSA 标准溶液，依次添加磷酸盐缓冲液（PBS）500、400、300、200、100、0 µL，加入1×G-250染色液5 mL，反应3 min后在波长595 nm处测定吸光度值，以标准液质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

供试品溶液制备及蛋白质含量测定：取天麻粉末2.00 g，加入去离子水100 mL，在沸水浴条件下提取2 次，每次126 min，滤过，合并滤液，即得天麻蛋白质溶液。精密量取适量稀释的样品溶液0.5 mL，加入1×G-250染色液5 mL反应3 min后在波长595 nm处测定吸光度值。

2.5 数据分析 采用SPSS 17.0 软件对实验数据进行处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 “略麻-1号”花茎及花的性状

“略麻-1号”花茎颜色为橙红色，花茎平均高度为125.10 cm，比安徽红天麻高33.8%；花茎平均粗度为12.01 mm；花序轴长平均为41.73 cm，比安徽红天麻高86.29%；花被筒平均长度为10.08 mm，宽度平均为6.57 mm，长宽比平均为1.53，花子房长度平均为9.79 mm。与对照品种安徽红天麻相比，“略麻-1号”花茎高和花序轴较长（图2～3）。

图2 安徽红天麻和“略麻-1号”花茎

图3 安徽红天麻和“略麻-1号”花茎及花的性状（±s, n=60）

3.2 “略麻-1号”果实性状

“略麻-1号”果实为红褐色，长度平均为25.17 mm，宽度平均为7.21 mm，长宽比平均为3.49，其长度、宽度比安徽红天麻分别高25.10%、2.70%；单个果实鲜质量平均为0.72 g，比安徽红天麻高63.64%；每株果实数量平均为62 个，比安徽红天麻多12.72%。与安徽红天麻相比，“略麻-1号”果实长且宽，鲜质量大，单株数量多（图4）。

图4 安徽红天麻和“略麻-1号”果实性状（±s, n=60）

3.3 “略麻-1号”种茎及箭麻性状

“略麻-1 号”种茎短粗成子弹状，色泽黄白色，无蜜环菌缠绕；箭麻病虫害少，呈扁平状或长筒状，平均长138.41 mm、宽60.93 mm，环纹清晰。安徽红杆箭麻较细长，环纹较浅，平均长137.04 mm、宽47.50 mm（图5～7）。

图5 安徽红天麻和“略麻-1号”的种茎

3.4 “略麻-1号”品质分析

“略麻-1号”折干率适中，为14.31%，其天麻素和对羟基苯甲醇质量分数之和为0.42%，比安徽红天麻提高了35.48%。“略麻-1号”多糖、蛋白质质量分数分别为16.60%、6.07%，与安徽红天麻差异无统计学意义。

图6 安徽红天麻和“略麻-1号”的箭麻

图7 安徽红天麻和“略麻-1号”的长度及宽度（±s, n=60）

3.5 “略麻-1号”产量分析

“略麻-1号”天麻总产量及白麻产量均显著高于安徽红天麻。“略麻-1号”平均单窝产量为2 495.50 g，安徽红天麻平均单窝产量为1 235.55 g，总产量提高了101.97%。“略麻-1号”箭麻、白麻平均单窝产量分别为1 240.50、1 269.00 g，比安徽红天麻提高了48.92%、180.96%。

4 讨论

天麻种植方式一般为无性繁殖和有性繁殖，无性繁殖见效快，但长期无性繁殖易导致天麻种性退化、病害严重，产量及品质下降[25-26]；有性繁殖有效克服无性繁殖种性退化问题，同时为定向培育优质种麻提供有效途径[27]。天麻选育过程中，利用有性繁殖技术并通过杂交或自交育种技术可培育无退化、产量高、品质好的天麻品种[28-29]。天麻蒴果数越多，单蒴果质量越大，种子数越多[27]，更有利于天麻种子培育和有性繁殖。随着天麻大面积栽培，病虫害问题日益严重，导致天麻品质变劣、产量降低甚至绝收[30-31]。因此，选育抗病性强的天麻新品种是防治病害、提高产量的有效途径之一。高产高含量的天麻新品种也陆续选育成功，如高产新品种“鄂天麻1号”“鄂天麻2号”[32-33]。

本研究通过人工授粉有性繁殖，多代自交选育获得优质新品系“略麻-1 号”，与安徽红天麻相比，“略麻-1号”花茎高且粗，花序轴长（41.73 cm）且花序多；果实长且宽、鲜质量大（0.72 g）且数量多；种茎短粗呈子弹状，色泽黄白色，无蜜环菌缠绕，无退化现象。“略麻-1号”病虫害少且总产量提高101.97%，天麻素与对羟基苯甲醇总含量比《中国药典》2020 年版标准规定的含量高了68%。结果表明，“略麻-1号”抗病强、产量高、药用成分含量高、繁殖力强且种茎无退化现象，为天麻种植提供优质的种源。“略麻-1号”选育及推广可为优质商品天麻提供重要种质资源，实现天麻增产增收，促进天麻产业可持续发展。