华重楼种子无菌萌发及实生苗培养初探

唐兴国，周全，陈银龙，米敏

(1.台州市农业科学研究院，浙江 临海 317000；2.武汉宜稞生态农业有限公司，湖北 武汉 430415)

华重楼是我国传统名贵药材，是广义百合科重楼属(Paris)多种植物的统称，以干燥根茎入药，具有消肿止痛、清热解毒、凉肝定惊等功效[1]。现代药理研究表明，重楼所含有的活性成分具有抗癌止血、镇静镇痛、祛痰平喘、止咳抑菌和抗细胞毒等多种功效[2-5]。重楼是云南白药、季德胜蛇药片、宫血宁、热毒清等著名中成药的主要原料药之一[6-7]，市场需求旺盛。重楼中药材的市场供应长期依赖野外采挖，由于无节制采挖和生态环境恶化，野生重楼资源日渐枯竭，近几年国内重楼产新呈逐年衰减趋势，2019年国内各产区加起来产新不足400 t，市场需求缺口巨大[8-9]。过去几年，国内每年需从越南、缅甸、尼泊尔、巴基斯坦等国进口重楼用以补充缺口，但进口重楼药材质量良莠不齐，有效成分含量难以达到新版药典0.6%的要求[10-11]。随着国内对重楼药材品质要求的提高，供需缺口将持续拉大。从长远考虑，为了保护野生重楼植物资源，也为了稳定市场供给，大力发展重楼人工栽培，以家种重楼药材替代野外采挖已成为必然选择。

华重楼(Parispolyphyllavar.chinensis)别名蚤休、七叶一枝花[12]，是2020版中国药典收载的重楼药材的基源植物之一[11]。华重楼常规繁育方式有种子繁殖、根茎营养繁殖和组培快繁[13]。自然条件下重楼种子萌芽缓慢、出苗率很低，且种苗质量参差不齐[14-16]；根茎繁殖需大量消耗药材原料，繁殖系数偏低、成本很高；组培快繁技术可很好保持母株的优良特性，且材料用量少、繁殖效率高，是华重楼繁育技术研究的理想突破方向[13]。

本实验拟采用华重楼的成熟种子为外植体，重点探讨华重楼种子无菌萌发过程中的外植体消毒、实生苗诱导与增殖等问题。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为野生驯化的高秆粉质华重楼当年新鲜种子，母株栽植于台州市农业科学研究院重楼种质圃，待蒴果浅裂、种子部分外漏时采收。

1.2 方法

1.2.1 外植体的取材及预处理

选择天气晴好的上午10点左右采样，取回的蒴果先用流水反复冲洗，再用洗涤剂清洗去污，然后剥离种子留作外植体。

1.2.2 外植体的消毒

外植体分别以2%、5%、10% NaClO溶液浸泡5、10、15、20 min，共计12个处理，同时以0.1% HgCl2溶液浸泡外植体10 min作为参照。具体操作流程为：将分离为颗粒的华重楼种子用纱布包裹后在自来水中冲洗1 h，再进行表面消毒，之后用无菌蒸馏水冲洗5次，最后用无菌吸水纸吸干表面水分。将经过消毒的种子接入附加0.3 mg·L-16-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、0.1 mg·L-11-萘乙酸(NAA)、30 g·L-1蔗糖的MS固体培养基培养28 d，分别统计外植体污染率和存活率。

污染率=已污染外植体总数/接种外植体总数×100%。

存活率=存活外植体总数/接种外植体总数×100%。

1.2.3 实生苗诱导条件的正交试验优化

以30 g·L-1蔗糖和8 g·L-1琼脂的基本培养基 (MS)为基础培养基，分别以种子前处理方式、培养基中6-BA浓度和NAA浓度为参比因子，设计L9(34)正交试验，探索适宜于华重楼种子无菌萌发的培养条件，试验方案见表1。将经过外植体消毒后存活下来确认无污染的华重楼种子分类处理后接入诱导培养基，25 ℃光照培养，40 d后统计芽诱导情况。

表1 实生苗诱导正交试验因素与水平设计

诱导率=成功诱导出苗的外植体总数/接种外植体总数×100%。

1.2.4 试验方法

试验中如未特别说明，培养条件一律控制在温度25 ℃，光照强度750～1 500 lx，光照10 h·d-1，空气相对湿度50%～70%。

所有培养基配好后均调pH 5.8，控制温度121～125 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2.5 数据处理

试验所得数据全部使用SPSS 19.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 外植体的消毒

外植体消毒前需完全分离，避免簇拥成团，消毒处理过程中动作轻柔，避免损伤外种皮。消毒试验详细结果见表2。

表2 外植体消毒试验结果

比较K-1～K-4的消毒效果，可以发现：当NaClO浓度为2%时(K-1～K-4)，不同处理时间下消毒效果都不理想，外植体基本全部染菌；当NaClO浓度为5%和10%时(K-5～K-12)，随着消毒时间延长，外植体染菌情况逐步缓解，但是当消毒时间延长到20 min时，外植体受消毒剂损伤严重，后期很难恢复，培养14 d后过半材料变褐凋亡；试验中采用0.1% HgCl2浸泡10 min进行了对比试验，发现适宜浓度的HgCl2与NaClO对华重楼种子的消毒效果大致相当。综合考虑试验可靠性和安全性，最终确定以5% NaClO浸泡15 min作为后续工作中外植体消毒的首选方法，避免将具有较大毒性和环境危害风险的HgCl2引入实验体系。

2.2 实生苗诱导条件正交试验结果

实生苗诱导条件正交试验结果见表3。将诱导率数据转换为反正弦值后输入SPSS 19.0进行方差分析得到表4。

表3 实生苗诱导条件正交试验结果

表4 各因素水平间差异显著性比较(SSR检验)

从表3可以发现：因素A(种子前处理)间的F=91.841，0.010.05，因素C(NAA用量)间的F=21.159，0.01C>B。进一步进行各因素水平的多重比较，结果记入表4。

表4结果显示，在重楼种子无菌萌发实验中，人工剥除外种皮和辅以赤霉素溶液浸泡均对种子无菌萌发有正向促进作用；培养基中适量添加NAA对种子无菌萌发也有明显影响；而6-BA的不同使用水平在实验中没表现出差异。综合以上分析，可以初步确定重楼种子无菌萌发的较适宜诱导条件为人工剥除外种皮、向培养基中添加0.25 mg·L-1的NAA和0.5 mg·L-1的6-BA。由于上述培养基配方不在正交试验的9种方案之内，故进行了试验验证，结果显示，剥除外种皮的华重楼种子在此培养基上培养40 d，实生苗诱导率接近70%，且华重楼无菌实生苗在此培养基上连续传代培养，可由单叶实生苗成功诱导出了多芽球茎和多叶大苗(图1)。

A—华重楼种子无菌萌发所得实生苗；B—华重楼实生苗继代后二次分化；C—华重楼实生苗分化出带有多个芽原基和根原基的小球茎；D—华重楼实生苗由单叶小苗分化形成的多叶大苗。图1 华重楼无菌实生苗诱导结果

3 小结与讨论

随着野生重楼资源的日趋枯竭，国内重楼中药材市场的供需失衡现象日渐凸显。通过发展重楼人工栽培技术，一方面可以稳定市场供给，另一方面也可保护野生重楼资源。而重楼人工栽培技术的关键技术瓶颈就在于种苗繁育。相较于种子繁殖和根茎营养繁殖，利用组织培养技术来繁育重楼种苗具有更广阔的开发前景[13]。通过诱导重楼种子无菌萌发获得实生苗的周期短，成苗率高，工作中以此为基础开展重楼组培扩繁技术的深入研究，可一定程度上规避重楼组培工作取材难、外植体消毒难、初代培养脱分化难等问题。因此，系统研究重楼种子无菌萌发技术具有其现实意义。

本试验在外植体消毒、种子无菌萌发条件优化方面做了一些探索，实验中发现经过人工剥除外种皮的华重楼种子在后续培养中启动更快、出苗率更高，且种子褐化少。这对开展重楼组培扩繁技术的相关研究具备一定的参考意义。这种现象与笔者在紫薇幼胚培养过程中观察到的一些现象有相似之处[17]，究其原因可能与种皮中富含的某些成分会抑制种胚的早期萌发有关。

本实验得到如下初步结论：随着表面消毒剂作用浓度升高和作用时间延长，种子活力会逐渐丧失，因此，应考量表面消毒效果与保持种子活力两者之间的平衡，实验中0.1% HgCl2浸泡10 min和5% NaClO浸泡15 min均可满足工作需要，综合考虑试验可靠性和安全性，最终选择以5% NaClO浸泡15 min作为外植体消毒的首选方法，避免将具有较大毒性和环境危害风险的HgCl2引入实验体系；人工剥除外种皮和辅以赤霉素溶液浸泡均对种子无菌萌发有正向促进作用，向培养基中适量添加6-BA、NAA对种子无菌萌发也有较明显影响，本实验确立的诱导重楼种子无菌萌发的培养条件为，人工剥除外种皮、向附加30 g·L-1蔗糖和8 g·L-1琼脂的MS培养基中添加0.25 mg·L-1的NAA和0.5 mg·L-1的6-BA。华重楼种子以此方法离体培养40 d，实生苗诱导率接近70%，实生苗在此培养基上连续传代培养，可由单叶实生苗诱导出了多芽球茎和多叶大苗。