桑黄子实体中多酚含量测定的方法学研究

孙雨晴，吴伟杰，钟石，霍进喜，朱俭勋，郜海燕，李有贵*

(浙江省农业科学院 a蚕桑与茶叶研究所，b食品研究所,浙江 杭州 310021)

桑黄是寄生于桑树等阔叶树上的大型真菌，具有抗炎、抗肿瘤、调节免疫等多种功效[1-8]。多酚是其发挥抗炎、抗肿瘤活性的重要活性成分[8-10]，因此,多酚含量是桑黄品质及药用价值的重要指标。但是不同的提取和测定方法测得的桑黄多酚含量差异较大[10-11]，导致桑黄品质好坏的判定标准不统一，不同研究间的结果也难以相互比较。目前桑黄没有收入药典，前人对其多酚含量的测定多直接参照其他中药材，缺乏针对桑黄本身的多酚测定方法学研究。本研究在参考前人研究方法的基础之上，采用单因素考察实验，逐一确定桑黄多酚的最佳提取方法，然后考察该提取测定方法的精密度、重复性、回收率、中间精密度等参数，最后利用该方法测定浙江地区不同来源的桑黄样品多酚含量，为桑黄的多酚含量测定提供方法依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

桑黄子实体样品由海宁宏欣农业生物科技公司、浙江千济方医药科技公司、淳安千岛湖桑都食用菌合作社提供。其中桑黄多酚提取方法优化研究中所用桑黄样品均为海宁宏欣农业生物科技公司提供。

ML-204分析天平(METTLER-TOLEDO，上海)，HH-6恒温水浴锅(晶玻实验仪器公司)，KQ-250E型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)，Cary60紫外-可见分光光度计(Agilent公司，美国)，UV-2800紫外可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司，上海)。

没食子酸(批号：C12504577，纯度99%)购于上海麦克林生化科技有限公司，甲醇(分析纯)购于上海凌峰化学试剂有限公司，乙醇(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司，磷钼钨酸(分析纯)购于北京华科盛精细化工产品贸易有限公司，碳酸钠(分析纯)购于兰溪市屹达化工试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸对照品50 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5 mL，置于50 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

1.2.2 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分别置25 mL棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液l mL，再分别加水11.5、11、10、9、8、7、6、5 mL，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min，以相应的试剂为空白，参照紫外-可见分光光度法，在760 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 供试品溶液的制备

在提取方法的考察实验中，供试品溶液采用不同考察方法下的操作步骤制备。最优提取方法建立后，精密度、重复性、回收率、中间精密度以及不同样品含量测定均采用所建立最优提取方法制备。

1.2.4 供试品多酚含量的测定

精密量取供试品溶液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1 mL，加水10 mL，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min，离心，取上清液，以相应的试剂为空白，在760 nm的波长处测定吸光度。从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的浓度，计算，即得。供试品溶液的多酚浓度超出标准曲线线性范围时，应稀释后再测。

1.2.5 粉碎粒度考察

取分别过三号筛、四号筛的粉末约1 g，精密称定，置锥形瓶中，加甲醇100 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取滤液2 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按照1.2.4节供试品多酚含量的测定方法测定多酚含量。

1.2.6 提取溶剂考察

取过三号筛的样品粉末约1 g，精密称定，置锥形瓶中，分别加入水、50%乙醇、50%甲醇、甲醇100 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用相应溶剂补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取滤液2 mL，置10 mL量瓶中，用相应溶剂稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按照方法1.2.4节供试品多酚含量的测定方法测定多酚含量。

1.2.7 提取方式考察

取过三号筛的样品粉末约1 g，精密称定，置锥形瓶中，加入50%乙醇100 mL，称定质量，分别超声处理30 min、70 ℃水浴回流1 h，冷却，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取滤液2 mL，置10 mL量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按照方法1.2.4节供试品多酚含量的测定方法测定多酚含量。

1.2.8 液料比考察

取过三号筛的样品粉末约1 g，精密称定，置锥形瓶中，分别加入50%乙醇100、150、200 mL，称定质量，70 ℃水浴回流1 h，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，分别精密量取滤液2、3、4 mL(对应溶剂量，使最后浓度一致)，置10 mL量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按照方法1.2.4节供试品多酚含量的测定方法测定多酚含量。

1.2.9 提取时间考察

取过三号筛的样品粉末约1 g，精密称定，置锥形瓶中，加入50%乙醇100 mL，称定质量，分别加热回流1、2、3、4、5 h，冷却，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取滤液2 mL，置10 mL量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按照方法1.2.4节供试品多酚含量的测定方法测定多酚含量。

1.2.10 精密度考察

取过三号筛的样品粉末约1 g，精密称定，置锥形瓶中，加入50%乙醇100 mL，称定质量，加热回流3 h，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取滤液10 mL，置50 mL量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。精密量取同一供试品溶液2 mL 6份，按照方法1.2.4节供试品多酚含量的测定方法测定多酚含量。

1.2.11 重复性考察

取过三号筛的样品粉末约1 g，精密称定，置锥形瓶中，加入50%乙醇100 mL，称定质量，加热回流3 h，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL，置10 mL量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按照方法1.2.4节供试品多酚含量的测定方法测定多酚含量。

1.2.12 回收率考察

取过三号筛的样品粉末约0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，加入一定量的没食子酸(分别相当0.5 g样品含量的80%、100%、120%，各平行操作3份)，加入50%乙醇100 mL，称定质量，加热回流3 h，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取滤液2 mL，置10 mL量瓶中，用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。按照方法1.2.4节供试品多酚含量的测定方法测定多酚含量。

1.2.13 中间精密度考察

由不同实验人员于不同时间取本品粉末约1 g，按重复性考察实验，平行操作6份，分别于不同仪器上测定。

1.3 10批桑黄样品的测定

按照重复性考察的方法，测定10批不同生产厂家的桑黄产品多酚含量，每个样品平行操作2份。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

标准曲线的回归方程为y=3.379x+0.034 2，R=0.999 8，表明没食子酸在25～350 μg线性关系良好。

2.2 粉碎粒度

通过三号筛粉末提取所测得的多酚含量为2.99%，通过四号筛的粉末所测得的多酚含量为2.74%，因此,选择多酚含量更高的三号筛。

2.3 提取溶剂

结果表明，水、50%乙醇、50%甲醇、甲醇提取所测得的多酚含量分别为0.72%、5.48%、4.76%、3.26%，以50%乙醇为溶剂的提取效率显著高于其他溶剂，所以选取50%乙醇作为提取溶剂。

2.4 提取方式

常温超声处理所测得的多酚含量为5.61%，70 ℃水浴回流处理所测得的多酚含量为7.38%，70 ℃回流处理的多酚含量显著高于超声处理，所以选取70 ℃水浴回流处理作为提取方式。

2.5 液料比

提取1 g桑黄样品加入提取溶剂100、150、200 mL所测得多酚的含量分别为7.37%、7.38%、7.39%，提取溶剂用量对提取效率的影响差异并不显著，因此,选用更加节省溶剂的100 mL作为提取溶剂的体积，即料液比为1∶100。

2.6 提取时间

提取时间1、2、3、4、5 h所测得多酚的含量分别为7.37%、7.67%、8.32%、8.35%、8.35%，提取效率到3 h以后变化不大，因此,选择3 h作为提取时间。

2.7 精密度

在单因素考察提取方法后，确定了桑黄粉碎粒度为过三号筛、1 g桑黄粉加入100 mL 50%乙醇水浴加热回流3 h的桑黄多酚提取方法。在该提取方法下提取的供试品溶液，经磷钼钨酸显色法测定6次，多酚含量分别为8.29%、8.27%、8.27%、8.41%、8.38%、8.27%，相对标准偏差(RSD)为0.76%，表明磷钼钨酸显色法用于测定桑黄多酚精密度良好。

2.8 重复性

同一样品经同样提取步骤平行操作6份，测得多酚含量分别为8.44%、8.05%、8.09%、8.00%、8.17%、8.24%，RSD为1.95%，结果表明,该提取和测定方法重复性良好。

2.9 回收率

表1显示，本方法的加标回收率在97.95%～106.46%，平均回收率102.11%，RSD为2.92%，表明本方法的准确度良好。

表1 没食子酸加样回收率(n=9)

2.10 中间精密度

2个实验人员的12份样品多酚含量检测结果(表2)表明中间精密度良好。

2.11 10批浙江省内桑黄样品多酚含量

在确定了本研究优化的方法具有良好的精密度、重复性、回收率之后，本研究测定了浙江省内10份不同来源或不同批次的人工栽培桑黄子实体切片样品中的多酚含量。结果显示，10份样品多酚含量在3.98%～8.54%(样品干重百分比)，不同厂家生产的桑黄子实体的多酚含量差异较大，多酚含量最高的是含量最低样品的2倍多。同一公司不同生产批次的样品多酚含量也存在差异，但是差异较小(表3)。

表2 中间精密度实验结果

表3 10批浙江省不同厂家桑黄子实体样品多酚含量

本研究测定的桑黄样品多酚含量与其他文献报道的桑黄多酚含量差异较大。雷萍等[11]将4 g桑黄样品加入100 mL的70%乙醇55 ℃超声提取60 min，提取2遍，用Folin-Ciocalteu比色法测定鲍姆桑黄5个品种(均来源于陕西省微生物研究所微生物技术研究中心)子实体，其多酚含量在1.11%～4.05%。《安徽省中药饮片炮制规范(2019年版)》[12]采用方法为0.1 g样品加入甲醇50 mL超声处理30 min的提取方法，用磷钼钨酸显色法测得的安徽省内10份桑黄样品的多酚含量为1.98%～4.77%。与其他文献中报道的桑黄多酚含量相比，本研究中的桑黄多酚含量明显提高。造成以上差异的原因，可能与提取方法、桑黄品种及产地、栽培方式等有关。

3 小结

本文开展了桑黄子实体多酚含量测定的方法学研究。多酚测定方法以没食子酸为标准品，采用磷钼钨酸显色法测定，该法在多酚(以没食子酸计)含量25～350 μg范围内线性关系良好。依次考察了桑黄子实体的粉碎粒度、提取溶剂、提取方法、料液比、提取时间等提取条件对多酚含量的影响，最后确定了粉碎粒度为过三号筛、料液比1∶100、50%乙醇70 ℃水浴加热回流3 h的多酚提取条件。经方法学验证表明，该桑黄多酚提取测定方法精密度、重复性、回收率、中间精密度均良好。利用该方法测定了来自浙江省内的10批桑黄样品，其多酚含量在桑黄干重的3.98%～8.54%，其中不同生产厂家桑黄子实体多酚含量差异较大，同一厂家不同批次的桑黄多酚含量差异较小。本研究为桑黄多酚的提取测定提供方法学依据，也为浙江省的桑黄中药饮片炮制规范中多酚检测限的制定提供重要依据。