Th17细胞在慢性阻塞性肺疾病肺患者外周血中的检测及其临床意义

谭建梅，王红嫚，罗俊，李有霞，谢仁雪

[遵义医科大学第五附属(珠海)医院呼吸与危重症医学科，广东 珠海 519100]

人类辅助性T细胞(CD4+T helper，Th)可根据其防御机体抵御不同类别病原体的能力而分为Th1、Th2、Th17等多个细胞亚群，而清除的病原体类别又取决于细胞因子[1]。Th17细胞通过分泌IL-17A、IL-22等发挥清除细胞外的细菌和真菌保护作用外，还可以在多种人类疾病中发挥致病作用[2-3]。多种炎性细胞参与的肺部及全身性炎症是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的重要病理机制之一，主要环节包括巨噬细胞/中性粒细胞/T细胞介导炎症反应活化，最终导致小气道狭窄，肺泡壁破坏，黏液高分泌等病理变化，炎症机制的研究有助于指导COPD诊断和治疗[4]。近年来发现Th17细胞在COPD病理机制中占有重要地位，Th17细胞在慢阻肺中的作用有大量临床前研究，但临床研究尚不足。因此，本研究检测COPD患者的外周血Th17细胞及细胞因子的应答水平，并分析其与临床指标的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 来自2021年4月—2021年10月于遵义医科大学第五附属(珠海)医院呼吸与危重症医学科接受治疗的慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)住院患者30例；本院内科、外科病房及门诊患者中的慢性阻塞性肺疾病稳定期(SCOPD)患者30例；实验室职工体检正常的健康对照者30例。纳入标准：①健康对照组(或健康非吸烟组)：无咽痛、咳嗽等呼吸道症状；不吸烟；血常规、肝肾功能、C反应蛋白、血糖、血脂、胸片及肺功能无异常；②SCOPD组及AECOPD组：符合GOLD 2021的诊断标准，入院接受治疗前的患者。排除标准(任何1项)：①合并有肝肾功能不全，血液系统及心脑血管严重疾病；②合并结核、肺癌、气胸、胸腔积液等其他肺部疾病患者；③有风湿系统疾病、免疫系统疾病，如类风湿关节炎、炎症性肠病、银屑病和牛皮癣等；④过敏体质患者；⑤有全身性慢性疾病且目前血糖、血脂、B型钠尿肽、甲状腺素等仍控制不良患者；⑥近2周使用口服或静脉激素者；⑦任何部位的恶性肿瘤；⑧不具备合作交流能力完成问卷。本研究遵循知情同意原则，经医院伦理委员会批准。

1.2 试验材料 淋巴细胞分离液ficoll试剂购自美国GE公司，胎牛血清购自美国Gbico公司，RPMI1640培养液购自贝索公司，APC标记的抗人CD3、PerCP-Cy5.5标记的抗人CD4、PE标记的抗人IL-17A、人的FCR阻断剂Fc1.3216、0.01 mol/L的FBS均购自美国BD公司，FITC标记的抗人 dead/live(FVS520)购自ebioscience公司，IL-17A、TNF-α和IL-22酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购自江苏酶免公司，淋巴细胞刺激阻断剂和固定破膜剂购自于美国BD公司。

1.3 单个核细胞的分离与刺激培养 收集COPD患者和健康志愿者的外周血约5 mL，利用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心后收集上层血浆，冻存于-80 ℃备用，收集中间的白膜层细胞即单个核细胞经无菌FBS洗涤后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液重悬，加入淋巴细胞刺激阻断剂，在37 ℃二氧化碳培养箱刺激孵育6 h后进行流式细胞染色分析。

1.4 流式细胞染色分析 收集体外刺激培养的细胞，用FBS清洗2次，加入APC标记的抗人CD3、PerCP-Cy5.5标记的抗人CD4、PE标记的抗人IL-17A、 FITC标记的抗人 dead/live(FVS520)、FCR阻断剂，于4 ℃避光染色30 min，PBS清洗2次后固定及破膜处理各30 min，离心后加入PE标记的抗人IL-17，于4 ℃避光染色30 min，FBS洗涤后利用流式细胞仪进行检测。

1.5 ELISA检测 收集的血浆用于IL-17A、IL-22和TNF-α的浓度检测，具体操作根据相关的ELISA检测试剂盒说明书执行。

1.6 肺功能检查 所有受试者的肺功能均由本院肺功能室在同一肺功能仪上完成。在测定前休息30 min，受试者先测定基础肺功能，然后吸入支气管舒张剂(沙丁胺醇)，休息15～20 min后重复肺功能检查。检测指标包括：FVC、FEV1%pred和FEV1/FVC%。

1.7 收集临床指标 收集年龄、性别、BMI、白蛋白、CRP、白细胞(WBC)、中性粒细胞比例(NEUT%)、淋巴细胞比例(LY%)等信息，使用CAT评分评估COPD患者综合健康状况，使用COPD-PS评分筛查健康对照组的COPD高危因素。

2 结果

2.1 受试者一般资料、肺功能及临床评价指标分析 本研究中，性别在3组之间差异无统计学意义(χ2=4.74，P=0.09)，3组受试者在年龄、BMI上差异均无统计学意义。AECOPD组白蛋白较健康对照组显著下降(P<0.05)；AECOPD组FVC、FEV1%pred低于SCOPD组，且SCOPD组低于健康对照组，COPD两亚组FEV1/FVC%均低于健康对照组(P均<0.05)；AECOPD组COPD-PS评分、CAT评分高于SCOPD组，SCOPD组高于健康对照组(P均<0.05)；AECOPD组较SCOPD组、健康对照组WBC、CRP明显升高，比较有统计学差异(P<0.05)，但SCOPD组较健康对照组，WBC、CRP无统计学差异；AECOPD组及SCOPD组患者NEUT%均高于健康对照组(P<0.05)，且LY%均低于健康对照组(P<0.05)，结果见表1。

表1 三组一般资料、肺功能及临床评价指标比较

2.2 受试者表达IL-17A的CD4+T 细胞比例及相关细胞因子水平 利用流式细胞术中的前向角散射(FSC)和侧向角散射(SSC)以及表面抗体的染色确定CD4+活细胞的圈门，进而分析CD3+IL-17A+T细胞在CD4+T 细胞中的表达水平作为Th17细胞比例。分析可见，AECOPD组患者外周血中Th17细胞、IL-17A高于SCOPD组，且SCOPD组高于健康对照组；COPD两亚组患者IL-22、TNF-α较健康对照组高，差异均有统计学意义(P<0.05)，但AECOPD组较SCOPD组IL-22、TNF-α未见明显差异，结果见图1、图2、表2。

注：*P<0.05。

注：A：前向角散射(FSC)和侧向角散射(SSC)圈出淋巴细胞群P1；B：在P1细胞群中，用FITC标记的抗人dead/live(FVS520)圈出活细胞，命名为R7；C：在R7细胞群中，用 PerCP-Cy5.5标记的抗人CD4圈出CD4+细胞群，命名为R10；D：在R10细胞群中，用APC标记的抗人CD3、 PE标记的抗人IL-17A圈出IL-17A+CD3+/CD4+活细胞比例。

表2 三组表达IL-17A CD4+T细胞比例及相关细胞因子水平比较

2.3 受试者外周血Th17细胞比例与肺功能、临床评价指标的相关性 在COPD合并组及AECOPD组中，Th17细胞比例与FVC、FEV1%pred和FEV1/FVC%均呈负相关(P<0.05)，且Th17细胞比例与CAT评分呈正相关(P<0.05)，SCOPD组均未见相关性，结果见表3。

表3 受试者外周血Th17细胞比例与肺功能、临床评价指标的相关性

2.4 COPD患者Th17细胞比例与炎性指标的相关性分析 在COPD合并组中Th17细胞比例与IL-17A 、IL-22、TNF-α、NEUT%均呈正相关(P均<0.05)，在AECOPD组中，Th17细胞比例与IL-17A呈显著正相关(P<0.05)，SCOPD组Th17细胞比例与炎性指标间均未见相关性，结果见表4。

表4 受试者Th17细胞比例与炎症反应指标的相关性

2.5 COPD患者肺功能与炎症反应指标的相关性 本研究从COPD患者总体分析，FEV1%pred与IL-17A、IL-22、TNF-α分别呈负相关(P<0.05)，FEV1/FVC%与IL-17A、IL-22呈负相关(P<0.05)；另行亚组分析发现，AECOPD组中，均未表现出显著相关性，见表5。

表5 COPD患者肺功能与炎症反应指标的相关性

3 讨论

3.1 Th17细胞在COPD发生发展中的作用 COPD患者肺部的慢性炎症以巨噬细胞和中性粒细胞浸润为特征，但气道壁中的淋巴细胞也增加[5]。区别于非肺气肿的吸烟者，COPD患者T淋巴细胞位于肺气肿实质破坏的部位[6]，免疫细胞的失调导致进行性肺部炎症、组织损伤和细胞重塑。Th17细胞的表型异质性及可分化的高可塑性使其在多种疾病中发挥不同功能。最近的证据表明，Th17细胞的分化表型是可逆的，并且在充分的刺激下可以获得不同的效应表型特征[7-9]。特别是处于抗原刺激持续存在的慢性炎症状态的Th17淋巴细胞，可以分别移向更具致病性的Th17/Th1或Th17/Th2表型，产生IFN-γ、T-bet等[10-12]。在COPD中，XU W H等[8]的研究提示Th17/Th1细胞的转化与COPD的全身性炎症有关。

本试验结果提示：与对照组相比，COPD患者Th17细胞比例显著升高，且AECOPD组患者较SCOPD组患者，Th17细胞比例也显著升高。更重要的是，本研究发现COPD患者外周血中的Th17 细胞比例与FEV1%pred之间呈负相关，表明Th17细胞在COPD发病机制中的潜在作用。由于Th17细胞可塑性是由慢性炎症驱动的[13]，认为Th17细胞与COPD的全身性炎症有关。既往研究结果也显示香烟暴露引起的慢性炎症Th17细胞的数量增加[14]，这与本研究结果相符。COPD的动态进程和严重程度高度依赖于抗原的暴露、患者的易感性和免疫反应的类型，免疫系统在肺部疾病的发生、恶化、发展和预后中起核心作用，而Th17细胞在COPD患者外周血中升高，其作用也被广泛研究，通过进一步探索，很可能为COPD的治疗提供新的靶点，例如干扰Th17细胞表型调节可能是在那些可能发生Th17细胞(尤其是向Th1表型)转移的炎症条件下新的治疗策略的可能目标。

3.2 Th17细胞与肺功能的关系 在本次研究中，与健康对照组比较，COPD患者FVC、FEV1/FVC%、FEV1%pred显著下降，且AECOPD 组较SCOPD组也显著下降。相关性分析显示，COPD合并组及AECOPD 组患者外周血Th17细胞比例与FVC、FEV1/FVC%、FEV1%pred呈负相关。这说明COPD患者肺功能下降与Th17细胞比例升高或功能异常具有一定相关性。另外有研究显示Th1细胞在COPD患者和健康吸烟者的血液中升高，但与气道阻塞无关，这表明Th17细胞可能与COPD的病理生理更相关[15]。肺功能指标是判断气流受限的客观性指标，用于诊断COPD并预测COPD的病死率，但肺功能指标在COPD患者中随时间变化相对较慢，不能准确预测患者疾病的短期或长期病程。生物标志物可能反映了COPD患者目前的肺部损伤的病理生理过程，因此可能与疾病活动水平有关[16]。本研究中Th17细胞比例与肺功能有相关性，所以Th17细胞有可能成为判断COPD严重程度及分期的新标志物。

3.3 炎症反应指标在慢阻肺中的作用 与大多数研究一致[15，17-18]，本研究发现，COPD患者较健康对照组IL -17A显著升高，且AECOPD组患者较SCOPD组患者IL -17A也显著升高；相关性分析提示COPD患者外周血中的IL -17A与FEV1%pred之间呈负相关，考虑IL-17A水平增加同样可反映慢阻肺患者的病情加重。研究表明，血清IL-17A水平升高可能与多种肺部疾病发病相关，例如COPD、结核、哮喘[19]。在慢阻肺的急性发作和慢性进展过程中，IL-17A 募集中性粒细胞的过程是清除多种定植菌的关键[20-21]，其抗感染功能可以降低COPD患者的感染风险；另一方面，在香烟烟雾诱导的肺气肿小鼠肺组织中，IL-17A持续分泌增加也引起嗜中性细胞性慢性炎症，导致进行性气道阻塞和肺气肿[22]。尽管IL-17A是Th17细胞所分泌的特征性细胞因子，但其来源并不仅仅局限于该细胞，它还普遍存在于肺部各种固有免疫及适应性免疫细胞中，来源相当广泛[23]。由于COPD患者肺部的慢性炎症以中性粒细胞浸润为特征，考虑IL-17A通过促进嗜中性粒细胞炎症可能是COPD病理生理学重要靶点之一。此外，本研究相关性分析显示，COPD患者外周血Th17细胞比例与IL-17A呈正相关，这说明尽管IL -17A来源广泛，COPD患者外周血中IL-17A水平增加仍可能反映COPD患者外周血中Th17细胞水平增加。

既往研究显示，COPD患者血液中的IL-22的浓度高于健康非吸烟者，但与健康吸烟者未见差异[24]。本研究中，COPD两亚组患者外周血中的IL-22的浓度分别高于健康对照组，COPD两亚组间IL-22未见明显变化。COPD合并组Th17细胞比例与IL-22的水平呈正相关。Th17细胞是IL-22和IL-17A的主要生产者，IL-22协同IL-17A诱导产生抗菌肽抵御病原体。有学者研究了IL-22在屏障表面的作用，IL-22与IL-17A一样都具有保护作用和促炎作用。IL-22究竟是促炎作用还是保护作用，研究显示可能与IL-17A和IL-22之间的平衡有关[25]，另外在疾病的不同阶段，IL-22也可能具有不同的作用[26]。有研究数据表明IL-17A和IL-22之间的平衡受损以及IL-22应答缺陷是COPD的主要特征，导致细菌感染和气道定植[27]。

本研究中，COPD两亚组患者外周血中的TNF-α的浓度高于健康对照组，但COPD两亚组患者外周血中的Th17细胞比例与TNF-α均未见相关性。TNF-α作为Th1细胞因子之一，相关研究提示具有高水平的Th1细胞因子的患者中，那些能够产生足够的Th17细胞因子的患者将比那些不能产生的患者具有更好的临床结局[28]。

3.4 研究中的不足 本课题组仅研究了外周血而未对支气管肺泡灌洗液或肺组织标本进行研究，这可能与COPD的发病机制更为相关。此外，一些COPD患者使用了吸入性糖皮质激素(ICS)，因此不能排除ICS影响Th17细胞、IL-17A、IL-22、TNF-α检测结果的可能性。尽管在纳入研究对象时采取随机抽样方式，但是因为研究规模有限，选择的对象均来自同一家医院，可能会出现选择性偏倚。

4 结论

COPD患者外周血中的Th17 细胞及IL-17A或可作为COPD疾病分期的指标反映COPD患者的病情加重，其在COPD的急性加重及慢性炎症中发挥不同作用，检测外周血中的IL-17A可反映Th17细胞水平。