宏基因组二代测序技术在肾移植术后肺部感染中的应用价值

黄晨，叶雨，罗海凤，聂峰，孙煦勇，秦科，董建辉，李壮江，王洪良

(1. 中国人民解放军联勤保障部队第九二三医院，广西 南宁 530021；2. 广西医科大学第二附属医院，广西 南宁 530005)

肾移植治疗是终末期肾病的有效治疗方法之一[1]。肾移植术受者需要长期口服免疫抑制剂，术后免疫功能低下，部分患者还常合并糖尿病、贫血、粒细胞减少等并发症，因而感染成为肾移植术后的主要并发症之一，尤其是肺部感染，其发病率在5%～14.96%[2-4]。往往病势凶险，迅速进展为重症肺炎，并可能继发排斥反应、胰腺炎、多器官功能不全，继而危及患者生命。因此治疗上需要尽快采用敏感药物控制感染，而明确病原体则是关键一环。近年来宏基因组二代测序技术 (metagenomics nextgeneration sequencing，mNGS)逐渐发展成为检测病原体的新手段，此方法快速精准，阳性率高，可准确客观且快速高效地检测多种病原微生物[5-6]，本中心运用该法对肾移植术后肺部感染患者进行病原学检测，治疗效果显著提高，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年1月—2020年1月在中国人民解放军联勤保障部队第九二三医院器官移植中心因肺部感染入院治疗的肾移植受者58例进行回顾性对照研究。(1)病例纳入标准：胸部影像学检查可见浸润影、实变影或磨玻璃影出现或进展，并兼含下列3项中2项以上：①发热，体温>38 ℃；②脓性气道分泌物；③白细胞>10×109/L或<4×109/L，并除外肺水肿、结核、栓塞、肿瘤、间质非感染性疾病、肺不张、嗜酸性粒细胞浸润症及肺血管炎等[7-8]。(2)排除标准：①临床资料欠完整致影响研究评估的准确性；② 因死亡或转院住院不足24 h的患者及病情未愈出院或转院者；③合并自身免疫性疾病、其他免疫功能缺陷疾病的患者；④多器官联合移植受者。(3)分组： 2016年1月—2018年5月为对照组，共31例，年龄16～57岁；男27例，女4例；感染发生时间距手术 1个月～12年，采用传统病原检测方法。2018年6月—2020年1月为mNGS组，共27例，年龄18～62岁，均为男性，感染发生时间距手术27 d～9年，均采用mNGS检测结合传统病原检测。

1.2 研究方法

1.2.1 检测方法 对照组于入院后尽早进行病原体检测及培养，重症患者行纤维支气管镜收集肺泡灌洗液送检，主要方法有：血清学反应、生化反应、直接涂片显微镜、分离培养、核酸分子杂交、PCR等。mNGS组在进行传统检测的同时，留取肺泡灌洗液及外周血送深圳华大基因股份有限公司做宏基因二代基因检测，灭活样本后，提取核酸并与已有基因数据库进行比较，获得报告结果序列号，过程符合生物安全条例。

1.2.2 结果判读 根据检测结果，对照组如能发现明确病原体，排除定植及污染的可能后，同时与临床特征相符，综合考虑后则判定结果为阳性，并据此结果调整抗感染方案，如不能明确病原微生物，则判定为阴性。mNGS组则以结果中某类病原微生物序列数个数为评价指标，检出序列号在100以上的病原体，同时与临床特征相符，综合考虑后则判定检测结果为阳性；或如果同时进行的任何传统试验为阳性，并且符合临床特征，则试验结果为阳性；如果检测结果为阳性，且没有临床相关感染或实验室细菌，则视为假阳性，如果检测结果为阴性，并且患者在经过抗感染治疗后明确表明感染有所改善，则定义为假阴性，需排除污染、定植等可能。

1.2.3 观察指标 观察两组患者年龄、性别比例、移植术后时间、免疫抑制剂方案、病原学检出率、检测结果回报时间、住院时间、住院费用、抗生素强度、治疗前后肝肾功能、空腹血糖、免疫抑制剂浓度、T细胞亚群等指标。

2 结果

2.1 两组一般资料的对比 两组在年龄、性别、治疗前CD4、CD8、D4/CD8、肌酐、ALT、血糖等基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。mNGS组住院时间明显短于对照组，治疗后mNGS组CD4/CD8、ALT值明显少于对照组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。两组之间住院费用差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后两组CD8、血糖值、血肌酐差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料对比

2.2 两组病原菌检验需要时间及检出率结果对比 mNGS组送检标本通过纤维支气管镜留取的肺部灌洗液为24例，外周血3例。检测需要时间明显短于对照组，阳性检出率明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义(P<0.05 )。见表2。对于mNGS组的病例，既采用宏基因二代测序法检测菌群和病毒，又采用传统检验病原菌法，统计结果显示两种方法差异有统计学意义(P<0.05)，高通量测序法检测需要时间明显减少，阳性检出率明显高于传统检验法。见表3。

表2 两组病原菌检验需要时间及检出率结果对比

表3 mNGS组两种检测方法结果对比

2.3 mNGS组检测病原菌结果

2.3.1 mNGS组检测结果 检出的病原菌包括细菌、病毒、真菌、放线菌，其中细菌包括：革兰阳性菌(副链球菌、婴儿链球菌、假肺炎链球菌、口腔链球菌、人葡萄球菌)、革兰阴性菌(浅黄奈瑟菌、长奈瑟菌、殊异韦荣球菌、痰二氧化碳噬纤维菌、流感嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌、坦纳拟普雷沃菌、产黑色普雷沃菌、苍白普雷沃菌、毗邻颗粒链菌)。病毒包括：人类疱疹病毒5型、人类疱疹病毒4型、人类β疱疹病毒5型。真菌包括：耶氏肺孢子虫、限制马拉色菌。放线菌包括：龋齿放线菌、黏液罗氏菌、奇异劳特罗普菌。该组病例按照传统方法检测，仅检测出革兰阴性菌：肺雷克雷伯菌、芳香黄杆菌、居泉沙雷菌，检测出真菌：曲霉菌、热带念珠菌、热带假丝酵母菌。

2.3.2 对照组检测结果 检出革兰阳性菌(表皮葡萄球菌1例)，检测出真菌(白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、都柏林假丝酵母菌各1例)，肺炎支原体和Q热立克次体各1例。

2.3.3 两线检测病原体结果对比 mNGS组中用宏基因二代测序检测了单个病原体排列最多的为耶氏肺孢子虫，而mNGS组采用传统检验病原体方法及对照组未能检测到耶氏肺孢子虫、人类疱疹病毒、奇异劳特罗普菌、普雷沃菌、链球菌、放线菌属，见表4。

表4 两组检测病原体结果对比

2.4 两组抗菌药物使用强度对比 抗菌药物使用强度计算公式，抗菌药物消耗量(累积DDD数)=抗菌药物消耗量(g)÷DDD值，单个患者抗菌药物使用强度=(抗菌药物消耗量×100)÷(1×住院天数)，排除了抗病毒药物及抗结核药物的使用强度。抗菌药物DDD值见表5。mNGS组抗菌药物使用强度明显少于对照组，mNGS组与对照组之间比较差异有统计学意义(P<0.05 )，见表6。

表5 抗菌药物DDD值

3 讨论

临床肾移植中心在肾移植围手术期会使用生物制剂的免疫诱导治疗，使受者免疫力短期内显著下降。另外，他克莫司等强效免疫抑制剂的广泛使用，也使得围手术期后的受者机体免疫缺陷状况持续维持，与正常人相比更易发生各种严重的细菌、真菌、病毒、结核等感染，且多为复合性感染。另一方面，供者来源性感染也不少见，文献报道发生率为0.2%～1.7%，多数发生在移植术后1个月内[9]352。同时由于抗生素的不合理使用，耐药病原微生物感染病例逐渐增多。在此背景下肾移植术后感染往往起病急、进展快、病死率高。一旦发生多重耐药细菌感染，病死率高达40.4%[9]352。因此，尽快明确感染源有效指导治疗是治愈感染、降低受者死亡率并尽可能避免移植肾失功能的关键。

本研究通过比较分析发现，与传统的微生物培养检测手段不同，mNGS直接从临床标本(肺组织、支气管肺泡灌洗液、血清、深痰等)中提取核酸并进行序列分析。根据与现有基因文库比较的序列信息，可以快速、客观地获得样本的结果。本研究中，mNGS组检测报告时间明显低于对照组，最短的从送检到获取报告仅2 d；总体病原体检出率达到100%，不仅明显高于对照组，而且检出比较罕见病原体如：灰黄色普氏菌1例、人类β疱疹病毒5型1例和坦纳拟普雷沃菌1例等，而常规培养方法不仅耗费时间长，且只检出有限种类的常见微生物。在时效性比较方面，mNGS法优势明显，为及时调整抗感染方案赢得了时间。尽早明确病原微生物，可避免传统的“大包围”抗感染策略，降低了抗生素使用强度，减少药物不良反应和耐药菌的产生，同时减少住院天数；相对对照组，mNGS组在器官功能保护上具有较大的优势，临床数据对比显示肝功能损害明显减少，且mNGS组CD4/CD8比值更低，意味着急性排斥反应发生的风险比对照组更低，不需要大幅调整免疫抑制剂方案，从而保证受者的肾功能稳定和长期生存。本研究两组资料中的移植肾功能方面差异不大，考虑与本中心在器官功能的维护方面有丰富的经验且尽量控制或减少具有肾功能损害副作用的抗生素有关[10]。

在灵敏度高，阳性病原种类多的情况下，检测结果的特异性如何是临床医生进行针对性治疗关切的问题。在本研究中mNGS组27例同时进行了mNGS和传统检测，其中21例传统检测阴性的病例mNGS检测呈阳性，充分表明了mNGS在灵敏度上具有巨大的优势，与文献报告结果相符[11]。文献报道肾移植术后重症肺炎受者行mNGS检测在提高病原学检测阳性率的同时，其结果也更容易被临床医生采信[12]。检出序列数是指与该病原体序列相匹配的序列数目，其数目与标本所含病原体载量、核酸提取量等有关。检出序列数值与标本中含有该病原体的可信度成正比，一般而言，某病原体检测深度、离散度越高，检出其序列数、基因组覆盖度越高，则检测到该病原体可靠性越高[13]。文献报道[14]通过mNGS辅助诊断非HIV相关耶氏肺孢子菌合并巨细胞病毒肺炎1例，该病例提示在免疫功能不全的重症肺炎患者中，通过进行mNGS病原体检测可及时指导临床医生选择正确的抗感染治疗方案，改善患者预后。本研究考虑序列数在100以上的病原体，在解读报告时，要充分掌握以上概念，结合临床特征综合判断，mNGS检测报告中提示某种/某些微生物检出序列数较高、基因组覆盖度高，表示检测到该病原微生物；在排除背景菌、污染菌和定植菌的情况下，可以考虑该微生物是致病病原体。本研究两组病例对照中，mNGS组根据结果判读后采取的抗感染治疗，在抗菌药物强度低的同时，缩短了住院时间，也证明mNGS检测结果具有较好的特异性。

本研究中，mNGS组阳性率最高的病原体为耶氏肺孢子虫(14/27，51.85%)，而传统检测手段则无论在mNGS组还是对照组均未能检测出肺孢子菌。事实上，肺孢子菌肺炎是一种机会性真菌感染，主要发生在器官移植受者，包括获得性免疫缺陷综合征等免疫缺陷患者，文献报道其在危险人群中发病率并不低[15]。但目前国内肺孢子菌肺炎获得的病原学证据较少，以经验性诊断为主，缺乏精准有效的治疗手段，常常导致病情延误，有报道称肺孢子菌肺炎早期如果得不到及时有效的治疗，其病死率可达90%～100%[16]。本研究在病情允许下入院3 d内进行肺泡灌洗液的mNGS检测，结果表明对耶氏肺孢子虫的检测具有较高的敏感度，结合临床表现、影像和实验室检测等资料，进行精准治疗，从而获得良好疗效。

综上所述，本研究发现mNGS作为一种病原微生物的新型检测方法，可提高病原体的检出率，从而提高治疗效率，包括减少抗感染药物使用强度，治疗更加合理、有针对性，减少药物不良反应，缩短住院天数。尽管该技术在临床应用中仍有不足之处，如费用较高、无法提供药敏结果、无法区分阳性病原体究竟是定植菌还是病原体等。但应用mNGS技术可为疾病的治疗提供“快、精且准”的指向，与传统病原学诊断方法相辅相成，为肾移植术后肺部感染的能够早期检测感染源，指导临床用药提供了科学依据，值得在临床上推广应用。