正交试验设计法优选夏枯草的提取工艺*

吴勇辉，杨定霖

(1.南方医科大学第七附属医院药剂科，广东 佛山 528244；2.佛山市仁汇医药科技有限公司，广东 佛山 528000)

夏枯草为唇形科夏枯草属的果穗，多年生草本植物。中医认为其具有散结消肿、清热解毒、清火明目等功效，可治疗目赤肿痛、瘰 疬、瘿瘤、乳痈肿痛、乳癖等[1]。现代药理研究发现，夏枯草对乳腺增生、乳腺肿瘤等具有较好的疗效[2-3]。前期，采用细胞膜固相色谱法筛选出夏枯草中抗人乳腺癌细胞 MDA-MB-231的效应成分为迷迭香酸、芦丁等[4]。本研究拟以迷迭香酸、芦丁的总提取率作为考察指标，通过正交试验设计法优选夏枯草的最佳提取工艺，现报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 岛津LC-20A效液相色谱仪(包括 LC-20AT型四元泵系统，Prominence SIL-20A自动进样器，SPD-M20A型DVD检测器)购自日本SHIMADZU公司，电子天平(型号：JJ224BC型)购自常熟市双杰测试仪器厂，数控超声波清洗器(型号：0605T型)购自深圳市华策科技有限公司公司，芦丁对照品为成都埃法科技有限公司生产(批号：AZ21080201，规格：98%)，迷迭香酸对照品为成都埃法科技有限公司生产(批号：AF21020951，规格：98%)，夏枯草(产地：江苏)购自康美药业股份有限公司，乙腈(批号：20201124，规格：色谱纯)、甲醇(批号：20200806，规格：色谱纯)均购自霍尼韦尔贸易(上海)有限公司，磷酸(批号：20210403，规格：分析纯)购自天津市富宇精细化工有限公司，双蒸水为自制。

1.2方法

1.2.1色谱条件 色谱柱：Cosmosil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～10 min，25%～40%A；10～30 min，40%～48%A；30～35 min，48%～60%A；35～40 min，60%～60%A)；检测波长：340 nm；流速：1.0 mL/mL；柱温：室温；进样量：20 μL。

1.2.2溶液的配制

1.2.2.1混合对照品溶液的配制 精密称取芦丁对照品2 mg、迷迭香酸对照品10 mg，加甲醇超声溶解，配制成每1毫升含20 μg芦丁、100 μg迷迭香酸的混合对照品溶液。

1.2.2.2供试品溶液的配制 取夏枯草合并的提取液，过滤，滤液采用旋转蒸发仪在50 ℃下减压回收乙醇并浓缩得到浸膏，称重，取10 mg样品加甲醇定容到5 mL，超声溶解，过滤，制得供试品溶液。

1.2.3方法学考察

1.2.3.1系统适用性试验 吸取供试品溶液、对照品溶液按拟定色谱条件进样测定，对系统适用参数进行考察。

1.2.3.2线性范围考察 精密吸取混合对照品溶液适量，加甲醇稀释成芦丁浓度为20、15、10、5、2.5 μg/mL，迷迭香酸质量浓度为100.0、75.0、50.0、25.0、12.5 μg/mL的系列混合对照品溶液，精密吸取上述溶液各20 μL，按1.2.1项色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度(X)为横坐标、以峰面积(Y)为纵坐标绘制线性回归标准曲线，分别计算出芦丁、迷迭香酸的回归方程。

1.2.4正交试验设计优选夏枯草提取工艺 参照文献[5-7]及预试验结果基础上采用L9(34)正交试验表进行设计，以迷迭香酸、芦丁的总提取率作为考察指标，选取对迷迭香酸、芦丁总提取率影响较大的因素，即乙醇浓度(A)、溶剂用量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)作为考察因素，夏枯草提取正交设计因素水平见表1。按处方比例称取夏枯草，按正交试验表安排实验，测定提取液的体积、迷迭香酸与芦丁浓度，分别计算迷迭香酸、芦丁提取率[提取率=(提取量/实验中最高提取量)×100%]，以总提取率[(总提取率=(迷迭香酸提取率+芦丁提取率)/2]作为考察指标，进行直观分析、方差分析，优选夏枯草的最佳提取工艺。

表1 夏枯草提取正交设计因素水平

1.2.5工艺验证 按优选的最佳提取工艺提取3批夏枯草，制备夏枯草提取液，并对提取液进行芦丁、迷迭香酸含量测定，计算夏枯草中芦丁、迷迭香酸提取率量，并计算总提取率。总提取率=[(芦丁提取量/正交试验中最高提取量)×100%+(芦丁提取量/正交试验中最高提取量)×100%]/2。

2 结 果

2.1系统适用性试验 芦丁、迷迭香酸色谱峰保留时间分别为4.408、9.299 min；2个色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，芦丁、迷迭香酸色谱峰的理论板数分别为5 981、18 499。见图1。

2.2标准曲线制备及线性范围 芦丁、迷迭香酸回归方程分别为Y=66 365X-1 1891、Y=70 931X-70 915(r2=0.999 4、0.999 6)。见图2。芦丁、迷迭香酸质量浓度分别为2.5～20.0、12.50～100.00 μg/mL范围内均与峰面积线性关系良好。

2.3正交试验设计优选夏枯草提取工艺

2.3.1直观分析 各因素对实验结果影响主次为A>D>B>C，即乙醇浓度>提取次数>乙醇体积>提取时间，直观分析优选出的组合为A2B1C2D3，即加12倍量的60%乙醇，提取3次，每次1.0 h。见表2。

表2 夏枯草提取的正交试验直观分析

2.3.2方差分析 乙醇浓度(A)、提取次数(D)对实验结果影响明显，差异有统计学意义(P<0.05)；乙醇体积(B)、提取时间(C)对实验结果均无明显影响，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 夏枯草提取的正交试验方差分析

2.3.3工艺验证 3批夏枯草测定并计算夏枯草中芦丁、迷迭香酸的提取率量及总提取率结果,见表4。按优选的最佳提取工艺提取3批夏枯草提取液中芦丁、迷迭香酸的总提取率较高(92.5%)，超过正交试验号4工艺得到的总提取率(88.4%)，且提取量批次间差异较小，重复性较好。

表4 夏枯草最佳提取工艺验证试验

3 讨 论

乳腺癌是仅次于肺癌的第二大癌症，为女性发病率、病死率均较高的恶性肿瘤，发病率每年以2%～3%速度增加，病死率超过10%[8]。目前主要采用放、化疗和手术切除等治疗为主[9]。中医药治疗也有文献报道[10]，但较少见。夏枯草在治疗乳腺癌方面有基础和临床研究，并且效果均较明显[11-13]，但对其活性成分的研究较少见。

本研究在前期采用细胞膜固相色谱法筛选出夏枯草中抗人乳腺癌细胞 MDA-MB-231的效应成分为迷迭香酸、芦丁[4]，继续开展夏枯草的最佳提取工艺的研究，以迷迭香酸、芦丁的总提取率作为考察指标，通过正交试验设计法优选夏枯草的最佳提取工艺。

夏枯草提取工艺的研究较多见，包括应用正交试验设计法优化夏枯草的最佳提取工艺的文献报道也较多见，杨辉等[14]以齐墩果酸含量作为指标，采用正交试验设计法开展了优选夏枯草提取工艺的研究，优选结果：乙醇浓度为90%，用量为药材量的20倍，提取时间为40 min。陈富超等[15]以木犀草素含量作为指标，采用正交试验设计法开展了优选夏枯草提取工艺的研究，结果显示：乙醇浓度为60%，用量为药材量的10倍，提取3次，每次提取时间为30 min。李万林等[16]以总黄酮提取率作为指标，采用正交试验设计法开展了优选夏枯草提取工艺的研究，结果显示：乙醇浓度为70%，用量为药材量的16倍，提取时间为50 min。朱鹤云等[5]以迷迭香酸含量作为指标，采用正交试验设计法开展了优选夏枯草提取工艺的研究，结果显示：乙醇浓度为70%，用量为药材量的30倍，超声功率为400 W，提取时间为60 min。刘秀梅等[6]以芦丁含量作为指标，采用正交试验设计法开展了优选夏枯草提取工艺的研究，结果显示：乙醇浓度为65%，用量为药材量的12倍，提取2次，每次提取时间为120 min。李丹等[17]以齐墩果酸含量作为指标，采用正交试验设计法开展了优选夏枯草提取工艺的研究，结果显示：乙醇浓度为95%，用量为药材量的8倍，提取3次，每次提取时间为120 min。袁萍等[7]以总黄酮提取率作为指标，采用正交试验设计法开展了优选夏枯草提取工艺的研究，结果显示：乙醇浓度为60%，用量为药材量的10倍，提取2次，每次提取时间为90 min。目前缺少文献报道以迷迭香酸、芦丁总提取率作为考察指标，采用正交试验设计法开展优选夏枯草的提取工艺的研究。因此，开展以迷迭香酸、芦丁总提取率作为考察指标，通过正交试验设计法优选夏枯草的最佳提取工艺的研究具有一定价值。本研究结果显示，夏枯草最佳提取工艺中芦丁、迷迭香酸提取率均超过0.17、1.92 mg/g，与文献报道的芦丁、迷迭香酸提取率较为接近或超过[5-6,18]。本研究采用正交设计试验方法研究夏枯草中芦丁、迷迭香酸的最佳提取工艺，稳定、可行，但也存在试验的连续性、提取时间长等问题，下一步研究可考虑尝试采用其他方法，如均匀设计试验法、超声提取等方法。