海洋中碱性磷酸酶及其活性的研究进展

宋宪锐,宋晖,王丹,苏贝

(1.山东大学海洋研究院 青岛 266237;2.南方海洋科学与工程广东省实验室(珠海) 珠海 519000;3.自然资源部海洋减灾中心 北京 100194)

0 引言

碱性磷酸酶(AP)是海洋中广泛存在的酶,是磷酸单酯酶或磷酸单酯水解酶的亚类之一,催化酯键(C-O-P)断裂,最适宜p H值为碱性[1]。AP包括组成型和诱导型2种[2]:通常在磷酸盐浓度低于某阈值时AP表达大量增加,表明AP是诱导酶[3];但在磷酸盐不缺乏的环境中也检测到少量AP表达,表明少部分AP是组成酶[4]。目前已发现3个主要的原核AP家族即Pho A、PhoD和Pho X,其底物特异性和所需金属辅助因子均存在差异。

磷酸盐限制(磷限制)又被称为磷酸盐压力或磷酸盐缺乏,主要是指周围环境中的生物可利用的溶解态无机磷(DIP)的浓度明显低于生物对其的需求,即氮等元素相对于磷的化学计量比显著高于Redfield比值(N∶P=16∶1),从而限制生物生长[5]。在极度缺磷的海区,海洋微生物最主要的应对方式是产生AP,即通过水解大分子溶解态有机磷(DOP)为小分子DIP来缓解磷限制[6],因此碱性磷酸酶活性(APA)被认为是磷限制的重要指标[7-8]。

AP对海洋碳、氮、磷循环和调节生物群落组成都具有非常重要的意义。①AP可缓解浮游植物的磷限制,有利于提高其初级生产力[9-10],增强海洋对大气中二氧化碳的固定作用并增加随后流入深海的有机碳通量,进而对全球碳循环和海洋碳汇功能产生重要影响[11]。②AP水解DOP产生的DIP可刺激固氮生物的生长,有利于生物固氮[12]。模型研究结果表明,缓解磷限制可提高全球生物固氮速率的30%～60%[13-15],而在北大西洋甚至高达3倍左右[16]。③某些细菌在深海受到碳限制时会产生AP水解磷酸单酯,释放出可利用的溶解态有机碳(DOC)[17-18],从而缓解深海细菌的碳限制。④在磷限制环境中,大量产生AP的海洋微生物可在资源竞争中占据优势[19-20],因此对海洋生物群落组成产生重要影响(图1,其中I-AP表示细胞膜内的AP,C-AP表示附着在细胞膜或存在于周质空间的AP,D-AP表示海水中游离态的AP)。

图1 AP参与海洋碳、氮、磷循环的过程

本研究综述海洋中AP的来源和分类以及APA的研究方法、调节机制模型、时空分布特征和环境影响因子,旨在揭示其在海洋生物地球化学循环过程中的重要作用。

1 碱性磷酸酶的来源

AP主要由浮游植物[21-23]、浮游动物[24-25]和细菌[1,26]产生,并存在于细胞膜内、周质空间和海水中[27]。

1.1 浮游植物

海洋中的多种浮游植物在DIP缺乏的环境中能够产生AP,周围海水中的APA随之升高。例如:红海北部的磷酸盐浓度很低,其APA沿深度分布与聚球藻分布呈相关性,表明聚球藻是AP的重要贡献者[7];采用细胞特异性法可在束毛藻中测出APA[28];随着蓝藻的大量暴发,海水中的APA随之升高[29];单细胞APA分析结果表明,甲藻和硅藻都能活跃地产生AP[30-31]。

此外,不同种类的浮游植物对AP的贡献具有较大的空间差异性。例如:日本广岛湾的甲藻暴发依赖其他硅藻产生的AP[32];我国南海大亚湾在春季藻华外的时间段,硅藻是造成APA变化的主要原因[2];蒙特利海湾和我国东海的甲藻是APA的最重要来源,而硅藻对于AP的贡献较微小[19,22-33];马尾藻海表层海水中的束毛藻贡献总APA的81%[21,23]。

1.2 浮游动物

很多浮游动物也是AP的重要生产者。例如:地中海浮游动物的APA呈春季高和冬季低的特点,其中桡足类和水蚤类对整体AP的贡献较大,而蔓足类对特定AP的贡献较大[24];法国Toulon Bay浮游动物的APA占颗粒态APA的60%以上[25],此外该海域浮游动物的APA在5-8月较高且桡足类丰度较高,表明桡足类是AP的重要贡献者[34];由于浮游动物的昼夜迁移,北大西洋亚热带海区夜晚的表层APA比白天高2～3倍[35]。

1.3 细菌

细菌同样是AP的重要生产者,其水解DOP不仅能够提供自身生长所必需的DIP,而且能够提供DOC以缓解碳限制[18,36-37]。一方面,异养细菌对磷的需求比浮游植物高,对磷限制更加敏感[38-39],因此AP对于细菌生长具有更加重要的意义,如在日本海[1]、东北大西洋[26]和我国南海[2]等海域均发现细菌产生AP的过程;另一方面,当有机碳成为细菌生长的限制因子时,细菌将通过产生AP水解DOP释放DOC供自身利用,如在阿拉伯海中层水[40]和地中海近岸海域[17]均发现细菌产生AP的主要作用是水解DOP以提供其生长所需的DOC。

2 碱性磷酸酶活性的研究方法

APA通常采用水解荧光模拟底物法测定:将不发荧光的荧光模拟底物加入待测定的样品后,样品中的AP会水解荧光模拟底物的磷酸单酯键,使发荧光的标准荧光物质释放出来;这一过程伴随着荧光强度的改变,因此可通过检测培养前和达到最大水解速率后的荧光强度变化率来表征样品中的APA[41-42]。

通常使用的荧光模拟底物包括MUF-P[41]、MFP[43]、DiFMUP[44]和p NPP[7]。最 早 使 用MFP测定环境样品中的APA[43],其在测定荧光强度之前无须用缓冲液调节p H值,因此可连续测定,但价格昂贵;DiFMUP也可连续测定,但价格也较昂贵;p NPP可连续或单点测定,使用更安全,但稳定性较差。目前最常用的荧光模拟底物是MUF-P,其灵敏度高,即使在低温和低APA条件下也能提供可靠的测定结果,但缺点为不适合活细胞或连续测定[41]。

此外,酶标记荧光(ELF-97)单细胞APA技术可用来评估单个细胞的磷状况,主要用于APA的定性和半定量测定[45-47]。单细胞APA技术的原理是荧光标记底物与AP结合后产生不溶性的荧光沉淀物,可用显微镜观察产生AP的细胞及其亚细胞定位。该方法是测定浮游植物群落磷限制的辅助方法,在相关研究中被广泛使用[22,33,44,48]。

3 碱性磷酸酶的分类方法

AP的分类方法如表1所示。最常见的分类依据是根据滤膜有无和孔径大小,使用0.22μm(或0.20μm)的滤膜可将AP分为颗粒态和溶解态[49]:就亚细胞定位来说,颗粒态AP通常存在于细胞膜内和周质空间或附着于细胞膜上;溶解态AP则在细胞产生后,通过细胞分泌或裂解作用释放到自然环境中并发挥作用[50]。最近的研究表明,溶解态AP并不是完全溶解在海水中,而是部分附着于纳米颗粒或病毒上,因此该研究将传统意义上的溶解态AP细分为非溶解无细胞态(附着于纳米颗粒或病毒上)和溶解无细胞态[51]。

分类依据 类别 说明滤膜有无和孔径大小整体 无滤膜溶解态 ＜0.22μm(或0.20μm)颗粒态/细胞附着态 ＞0.22μm(或0.20μm)来源细菌产 来自细菌浮游植物产 来自浮游植物浮游动物产 来自浮游动物亲和力高亲和力 主要来自细菌(溶解态)低亲和力 主要来自浮游动物表达方式组成型 不受环境影响诱导型 受环境影响

根据AP来源,部分研究将颗粒态AP分为细菌产、浮游植物产和浮游动物产[3,52]。在一些研究中,AP被分为高亲和力和低亲和力2个类型,且不同粒径AP的贡献不同[25,53-54]。高亲和力AP主要来自细菌(溶解态)[55],占高亲和力部分比重达77%[54];低亲和力AP主要来自浮游动物[55],占低亲和力部分比重达83%[54]。此外,根据表达方式可将AP分为不受环境影响的组成型AP和受环境中低DIP影响的诱导型AP[4]。

4 碱性磷酸酶活性的调节机制模型

有学者以球形褐藻为例,首次尝试在已建立的浮游藻类模型中加入磷存储和AP表达等过程,该模型明确描述AP(去)抑制调节机制,并能够定性描述DIP转运、聚磷酸盐的细胞内积累、AP诱导和APA等观测结果[56]。采用该APA调节机制模型开展DIP限制和溶解态无机氮(DIN)富集的模拟实验,得到结论为如果DOP浓度不是限制因素,AP可显著提高浮游植物的生物量;该结论有沿海[22,53,57-58]和大洋生态系统[21,49,59-60]的大量现场观测数据支持,表明DOP对于维持DIP缺乏海域的初级生产力至关重要。

5 碱性磷酸酶活性的时空分布特征

5.1 水平分布特征

APA研究主要集中于热带和亚热带的太平洋、大西洋和地中海海域[10]。由于生物可利用DIP浓度较低,这些海域是全球主要的磷限制海域[5]。

在海上调查实验中发现,在同样的磷酸盐浓度环境下,亚热带大西洋的APA高于亚热带太平洋[10]。北大西洋接收大量来自撒哈拉沙漠的含铁沙尘,使其固氮生物的固氮效率提高,进一步加剧磷限制,因此其APA高于南大西洋,且据估算北大西洋的DOP可支持高达30%的初级生产力[60]。与同纬度的北太平洋相比,印度洋的APA较高,可能的原因是该海域充足的铁输入有利于浮游生物群落生长,营养盐被大量利用后须产生AP以缓解磷限制[61]。

5.2 垂直分布特征

磷限制主要出现在表层海水,深海磷酸盐通常不会是微生物生长的限制因素,因此APA研究主要集中于100 m以浅的海域,而深海APA研究较少。研究表明同一海域100 m以浅海水的APA较高且变化不大,而100 m以深海水的APA逐渐降低甚至低于检测限值。有学者在西北地中海观察到APA随深度增大而降低的现象[62-63],甚至有研究发现1 000 m处海水的APA比表层海水低1个数量级[64]。我国黄海有相同的规律,2007年夏季表层海水的APA约为100 nmol/(L·h),而深层海水的APA低于10 nmol/(L·h)甚至低于检测限值,这表明由于夏季黄海冷水团的存在,表层海水得不到营养物质补给,浮游植物可能遭受较强的磷限制,而底层冷水团营养物质充足,浮游植物不会遭受磷限制[65]。

5.3 季节分布特征

研究表明,同一海域的APA往往存在季节性变化,如在大西洋BATS站[66]、地中海亚得里亚海[67]、法国Toulon Bay[34]、旧金山和蒙特利海湾[22]、日本附近海湾[68]和我国黄海冷水团海域[65],APA的最高值均在春季和夏季测得,该时期由于浮游植物生长须利用大量DIP,海洋中的DIP浓度很低,使浮游植物通过大量产生AP以缓解磷限制。此外,有学者发现地中海APA的最高值出现在冬季[69],可能的原因是冬季的磷循环更加有效。

6 碱性磷酸酶活性的影响因子

APA在海洋生态系统中的调节机制十分复杂,研究表明多种环境因子可以影响APA,且共同发挥作用调节不同时空的APA分布。影响APA的典型环境因子包括太阳辐射[70-71]、海水温度[72]、河流输入[17,33]、上 升 流[73-75]、DOP[10,60,76]、DIP[44,49,77]、DIN[17,33,44,49]、金属离子[10,78-79]以及病毒裂解、浮游动物捕食和排遗作用等[80]。

6.1 太阳辐射

有研究发现UV-B可通过光降解作用显著降低颗粒态和溶解态APA,且对于溶解态APA的影响更大[70]。环境强度水平的紫外线也会降低游离态APA[71]。

6.2 海水温度

有研究发现红海海水升温导致APA降低[7],东北大西洋[26]和波罗的海[72]海水升温导致溶解态APA占比降低,在全球变暖趋势下将导致总APA降低,进而对DOP的水解作用造成影响。有实验表明,随着温度的升高,AP与其他胞外酶相比增加最慢。海水升温会减少微生物异养群落的营养供应,尤其是磷碳比的降低会减缓营养循环,进一步导致海洋贫营养化[81]。

6.3 河流输入

河流输入会降低近海的海水盐度,而鞭毛藻等可产生AP的浮游植物群落对于海水盐度的变化比较敏感,因此河流输入导致的海水盐度变化将调节浮游植物的AP表达[33]。此外,河流输入会带来大量营养盐,如河流输入为波河与亚得里亚海交界处的浮游生物提供大量营养盐,满足其对DIP的需求,位于该交界处的站点所测APA较交界处外的站点更低[17]。

6.4 上升流

海洋上升流通过将底层海水的营养盐带到海表以维持生物生长。例如:秋季地中海的上升流将磷酸盐输送到海表,缓解磷对浮游生物生长的限制并导致APA降低[52,59,73]。APA的高低往往取决于底层海水与表层海水之间的交换量[74,82],而上升流是影响该交换量的重要因素。

6.5 DOP

AP降解DOP对于贫营养海域的微生物生长十分重要,这些微生物能够根据DOP的生物可利用性来调节其对DOP的利用[76]。APA与DOP的相关关系在不同研究中呈现差异性:有研究表明APA与DOP呈负相关关系[10,60],可能的原因是较活跃的DOP可支持较高的APA,因此被大量降解;另有研究表明在DOP浓度较低的海水中,即使磷限制广泛存在而APA也较低,此时APA与DOP呈正相关关系,这表明DOP作为浮游生物(如束毛藻)的重要磷源,其浓度较低时会成为海水中APA的主要影响因子[77,83]。

6.6 DIP

生物APA往往受到细胞内磷状况和环境中磷酸盐浓度的影响。大量研究表明,当细胞内和环境中的DIP浓度较低时,往往需要细胞产生AP分解利用DOP,以产生DIP供细胞利用,因此APA较高,即APA与DIP呈负相关关系[17,44,49,57,73,77,84-87]。然而也有实验表明,尽管环境中的DIP浓度很高,但游离型APA仍维持较高水平,可能的原因是游离型AP能够在海洋环境中存在很长时间,且其产生和发挥作用是解耦联的[88]。

6.7 DIN

在海洋环境中,DIN的输入会进一步加剧磷限制,导致APA升高,如APA在亚热带北大西洋[44,49]、美国俄勒冈州海湾[75]、我国东海[33]和我国南海[89]等海域由于该原因而较高。此外,由于富氮化肥、城市废物和化石燃料等燃烧产生的氮氧化物进入海洋而造成人为氮输入,使相应海域的氮磷比变高,导致藻类生长受到磷限制[90],因此藻类会产生AP以缓解磷限制。

6.8 金属离子

AP催化活性中心的成分包括金属离子[91],其中Pho A型和Pho V型AP催化活性中心为锌离子[78,92],Pho X型AP催化活性中心为铁离子[79],因此AP在发挥作用时须有金属离子的参与。例如:在向亚热带北大西洋表层海水中添加锌离子后,水体中的APA升高,表明该海域较低的锌离子浓度抑制APA;而在向该海域表层海水中添加铁离子后,水体中的APA并没有升高,表明在该海域铁离子是APA的非限制性环境因子[10]。此外,由于不同类型的AP需要不同的金属离子作为辅助因子,低磷海水中铁离子和锌离子的浓度通过影响APA而成为决定浮游植物群落组成的关键因素[79]。

6.9 病毒裂解、浮游动物捕食和排遗作用等

病毒裂解、浮游动物捕食(使被捕食者的细胞破裂)和排遗作用等均为海洋中溶解态AP的来源[50,93]。此外,细菌应激和死亡增加溶解态胞外酶占总胞外酶的比重,其中AP的占比增加高达10.5%[80]。

7 展望

目前针对AP的大量研究主要集中在地中海、北大西洋和西北太平洋[10]等磷限制海域,而针对其他海域的AP研究较少,因此应逐步开展对其他海域的相关研究,从而为深入理解海洋环境中AP参与碳、氮、磷循环的过程提供重要条件[12]。尽管AP在海洋生物地球化学循环过程中发挥的作用被不断发现,但能够明确描述AP作用机制的模型鲜有报道[56],可能的原因是APA数据缺乏和数据库尚未建立,因此应整理现有APA数据并建立相应数据库,从而推动建模的发展。目前已对全球陆地生态系统的APA分布及其影响因子开展较为系统的研究[94],但对海洋生态系统的APA分布缺乏系统研究,因此应进一步研究典型海域APA的分布规律及其特征,厘清APA的调节机制,定位影响APA的关键环境因子,将APA纳入海洋生物地球化学和海洋生态系统模型的构建,从而提高海洋生态系统功能预测的准确性和完整性。目前许多研究选用的底物和方法存在差异[48,65],因此应制定统一标准,规范APA测定流程,从而实现APA数据的比对。虽然目前已对AP的作用机制有一些研究,但AP对不同海域浮游植物群落生长和物种组成的调节程度仍不明确,对于盐度等重要环境因子如何影响AP表达和APA仍研究不足,因此应进一步研究以得到明确的结论。