新型冠状病毒肺炎无症状感染者的临床与免疫学特征分析

申 川，秦 浩，马路园，李星宇，宋枚芳，张云涛，高会霞，王 洋，戴二黑，赵彩彦

新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）引起的一种以病毒性肺炎为突出表现的全身感染性疾病。截至到2022年7月26日，已导致全球200个以上的国家和地区超过5.6亿人感染，死亡人数达637万人[1]，严重影响了全球社会经济活动与人类的生活，也造成了巨大的经济损失。COVID-19的疾病谱中除包括轻型、普通型、重型、危重型患者外，还存在一部分“无症状”感染者。这些感染者无明显临床症状，尤其在聚集性感染病例中较为常见，常通过密切接触者筛查、聚集性疫情调查、传染源追踪调查发现，极易被忽视，且作为隐匿传染源可造成疫情广泛传播。本研究通过分析河北省COVID-19救治定点医院（石家庄市第五医院）2020年1月22日—6月22日期间确诊的COVID-19患者的临床资料，初步探讨COVID-19无症状感染者的临床特征和宿主T淋巴细胞亚群、细胞因子/趋化因子谱的特征，完善对COVID-19疾病谱及致病机理的认识，为疫情防控提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2020年1月22日—6月22日石家庄市第五医院收治的59例COVID-19患者作为研究对象，同时选取24例健康者作为对照组。本研究通过河北医科大学第三医院（科2020-009-1）、石家庄市第五医院（2020013）伦理委员会审核批准，所有研究对象均知情同意并签属知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 信息收集 收集59例COVID-19患者的人口学（年龄、性别等）资料、流行病学特征、临床表现、胸部CT等临床资料。

1.2.2 纳入、排除标准 纳入标准：参照《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第八版）》[2]，COVID-19患者须具有流行病学史，咽或鼻拭子SARS-CoV-2核酸检测阳性，伴或不伴临床表现、COVID-19胸部CT特征。排除标准：①疑似患者；②由其他病原体导致的肺部或全身感染、自身免疫性疾病、恶性肿瘤者；③无症状感染者应该排除入组时尚处于潜伏期而无症状，但随疾病进展出现相应临床表现的轻型、普通型、重型/危重型COVID-19患者。

1.2.3 患者分组 根据《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第八版）》[2]，将59例COVID-19患者分为4组：无症状感染组（n=28）、轻型组（n=6）、普通型组（n=19）、重型/危重型组（n=6）。无症状感染：核酸检测阳性至核酸转阴，自始至终不出现任何症状、体征和影像学表现。轻型：临床症状轻微，影像学检查未见COVID-19表现。普通型：具有发热、呼吸道等症状，影像学检查可见COVID-19表现。重型：符合以下情况之一者，①出现气促，呼吸频率≥30 次/min；②静息状态下，吸气时指氧饱和度≤93%；③动脉氧分压（PaO2）/吸氧浓度（FiO2）≤300 mmHg；④临床症状进行性加重，胸部影像学显示24～48 h内病灶明显进展（＞50%）。危重型：符合以下情况之一者，①出现呼吸衰竭，且需要机械通气；②出现休克；③合并其他器官功能衰竭，需ICU监护治疗。因重型、危重型患者例数较少，故将其合并为重型/危重型组。

1.2.4 标本采集与处理 留取59例COVID-19患者EDTA-K2抗凝管静脉血标本用于检测T细胞亚群计数；留取59例COVID-19患者和24例健康对照者的促凝管静脉血标本，分离血清后，置于-80 °C冰箱保存，检测细胞因子和趋化因子水平。首次血液标本采集在入院48 h（治疗前）内完成，根据临床诊治需要，部分患者同时采集入院第（14±2）d（治疗后）血液标本。全部检测均在符合生物安全要求的实验室完成。

1.2.5 T细胞亚群计数检测 取EDTA-K2抗凝血50 μl置于流式细胞管，加入 10 μl TriTESTCD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE抗体，室温避光温育15 min，加入溶血素2 ml，温育15 min后离心，PBS洗涤2次，用FACS-Canto II流式细胞仪（美国BD公司）检测T细胞亚群计数。

1.2.6 血清细胞因子和趋化因子检测 用Procarta Plex多细胞因子检测系统（美国Thermo Fisher公司）检测血清中25种细胞因子：IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1α、IL-1RA、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31、 粒 细 胞 -巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）及9种趋化因子：IL-8、干扰素诱导蛋白10（interferoninducible protein-10, IP-10）、嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）、生长调节致癌基因（growthrelated oncogene, GRO）-α、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1, MCP-1）、巨噬细胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein, MIP）-1α、MIP-1β、基质细胞衍生因子（stromal cell derived factor, SDF）-1α、调节激活正常T细胞表达和分泌的趋化因子（regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted, RANTES）的水平。具体方法为：将50 μl磁珠加入微孔板，离心弃去液体后，每孔加入25 μl缓冲液和25 μl样品或标准品，室温反应60～120 min，清洗微孔板2次，加入25 μl检测抗体混合液温育30 min后洗涤，再加入链霉亲和素-荧光色素偶联物温育30 min。采用LuminexTM200流式荧光检测仪读取数据。

1.3 统计学处理 用SPSS 26.0软件进行统计分析。计数资料以例数（%）表示，组间比较采用χ2检验。呈正态分布的计量资料以±s 表示，呈偏态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间总体差异比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间比较采用Bonferroni法校正。配对设计采用Wilcoxon符号秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 人口学数据和临床特征 59例COVID-19患者中，男性37例，女性22例，年龄31.0（22.0，49.0）岁；各组患者性别比较差异无统计学意义（χ2=0.716，P=0.869）。各组患者年龄比较，差异具有统计学意义（H=17.787，P=0.001），其中无症状感染组[23.0（19.3，34.8）岁]显著低于普通型组[35.0（24.0，52.0）岁]和重型/危重型组[64.5（52.0，68.3）岁]（P均＜0.05），而与轻型组[25.0（21.0，46.3）岁]比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。无症状感染组患者均无临床症状和特异性胸部CT病变，而普通型组、重型/危重型组具有不同程度的发热、乏力及呼吸道症状等，且至少存在累及1个肺叶的影像学改变。所有COVID-19患者均康复出院，无死亡病例，见表1。

表1 COVID-19患者的临床特征（例）Table 1 Clinical characteristics of patients with COVID-19 (cases)

2.2 各组COVID-19患者治疗前T细胞亚群计数的比较 所有COVID-19患者入院首次T细胞亚群检测结果显示：无症状感染组10例（35.7%）、轻型组0例、普通型组13例（68.4%）、重型/危重型组6例（100%）患者的CD4+T细胞计数低于正常值下限（参考范围：550～1440个/μl）；无症状感染组3例（10.7%）、轻型组0例、普通型组2例（10.5%）、重型/危重型组5例（83.3%）患者的CD8+T细胞计数低于正常值下限（参考范围：320～1250个/μl）。无症状感染组外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞计数均显著高于重型/危重型组（P均＜0.05），与轻型组比较差异均无统计学意义（P均＞0.05），无症状感染组CD4+T细胞计数显著高于普通型组（P＜0.05），见表2。

表2 各组COVID-19患者治疗前T细胞亚群计数的比较[M（P25，P75）]Table 2 Comparison of T-cell subsets in patients with various types of COVID-19 before treatment [M (P25, P75)]

2.3 各组COVID-19患者治疗前与治疗后T细胞亚群计数差值的比较 无症状感染组14例、普通型组13例、重型/危重型组6例患者在入院后第（14±2）d进行了第2次外周血T细胞亚群检测。与治疗前相比，治疗后无症状感染组4例（28.6%）、普通型组11例（84.6%）、重型/危重型组4例（66.7%）患者CD4+T细胞计数升高；无症状感染组8例（57.1%）、普通型组10例（76.9%）、重型/危重型组5例（83.3%）患者CD8+T细胞计数升高。14例无症状感染组患者治疗前与治疗后CD4+T细胞和CD8+T细胞计数比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表3。普通型组、重型/危重型组治疗后CD4+T细胞、CD8+T细胞计数均较治疗前有不同程度的回升，但仅CD4+T细胞计数在上述2组中的上升幅度显著高于无症状感染组的变化幅度，差异具有统计学意义（P均＜0.05），见表4。

表3 14例无症状感染者治疗前和治疗后T细胞亚群计数的变化[M（P25，P75）]Table 3 Changes of T cell subsets in 14 asymptomatic infected patients before and after treatment [M (P25, P75)]

表4 各组COVID-19患者治疗前后T细胞亚群计数差值的比较[M（P25，P75）]Table 4 Comparison of T cell subpopulation count differences between patients with various types of COVID-19 before and after treatment [M (P25, P75)]

2.4 各组COVID-19患者治疗前细胞因子和趋化因子表达谱的比较 无症状感染组24例、普通型组15例、重型/危重型组6例患者和24例健康对照者进行了外周血细胞因子和趋化因子的检测。统计发现，在34种细胞因子和趋化因子中，23种在COVID-19患者及健康对照者中不能被检测到，故未进行统计学分析。不同临床分型COVID-19患者及健康对照者的血清细胞因子和趋化因子水平见图1。无症状感染组血清IL-7水平显著高于对照组（P＜0.05），虽低于普通型组、重型/危重型组患者，但差异均无统计学意义（P均＞0.05）。无症状感染组血清IP-10水平均显著低于普通型组、重型/危重型组（P均＜0.05），但与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 各组COVID-19患者和对照组血清11种细胞因子和趋化因子水平直条矩形柱代表中位数，误差线代表四分位数间距；Kruskal-Wallis H检验比较多组间总体差异，IL-7：H=10.230，P=0.017；IL-8：H=1.101，P=0.777；IL-18：H=2.293，P=0.514；Eotaxin：H=2.152，P=0.411；GRO-α：H=2.797，P=0.424；IP-10：H=18.355，P=0.001；MCP-1：H=2.703，P=0.440；MIP-1α：H=2.271，P=0.518；MIP-1β：H=3.777，P=0.287；SDF-1α：H=7.393，P=0.060；RANTES：H=2.002，P=0.672；a. 与对照组比较，P＜0.05；b. 与普通型组比较，P＜0.05；c. 与重型/危重型组比较，P＜0.05Figure 1 Serum levels of 11 cytokines and chemokines in patients with COVID-19 in each group and control group

3 讨 论

COVID-19无症状感染者是指没有可以自觉感知的相关临床表现如发热、咳嗽、咽痛或可以临床识别的症状和体征，而从呼吸道等标本中检测出SARS-CoV-2核酸阳性的一组人群[3-4]。研究发现，2020年COVID-19疫情早期时无症状感染者的占比在1.6%～59.0%之间[5-6]；2021年广州暴发的德尔塔变异株疫情，无症状感染者占比为4.6%[7]；2022年上海奥密克戎变异株疫情中，无症状感染者高达90%以上[8]。这提示随着SARS-CoV-2病毒株的不断进化，病毒毒力下降，加之疫苗的广泛接种后形成免疫屏障，无症状感染者成为最主要的感染类型。无症状感染者因具有高度的隐匿性，早期识别困难，常在密切接触者筛检、聚集性疫情调查、对有境内外SARS-CoV-2持续传播地区旅行或居住史的人员开展主动核酸检测时发现，因此探索无症状感染者的临床及免疫学特征，有助于及时发现和遏制疫情传播。

本研究显示，COVID-19无症状感染者主要集中在青年人群，较少伴有基础疾病，而普通型主要为中青年患者，重型/危重型更多见于老年患者，提示COVID-19的严重程度有年龄分布差异，这与其他一些研究的结果一致[9-11]。老年患者因免疫防御功能障碍、免疫衰老、发生免疫病理损伤的风险增高，使其发生重型、危重型COVID-19病例的比例显著增高，并导致较高的病死率[12]。而年轻患者的T细胞和B细胞功能较强，能更好地控制病毒复制，同时减轻机体的炎症反应，使得患者未出现临床症状[13]。世界卫生组织的报告显示全球70万例COVID-19患者的男女比例为1.03:1，而本研究也未发现COVID-19严重程度存在性别差异。

既往研究证实，潜伏期无症状感染者与持续无症状感染者具有不同的免疫表型，如CD8+初始T细胞、CD107alow经典单核细胞、过渡型单核细胞等亚群比例降低，并存在单核细胞过渡活化和分化抑制现象，提示2种“无症状”具有截然不同的进展方向[14]。本研究在纳入无症状感染者作为研究对象时，排除了处于潜伏期的COVID-19轻型、普通型、重型/危重型患者，只纳入属于持续无症状感染者，因此能真实反映该类型患者的免疫状态。

宿主免疫功能是决定感染性疾病临床转归的决定性因素之一。与前期一些研究结果相同，本研究也观察到CD4+和CD8+T细胞计数在COVID-19患者中随疾病进展明显降低，尤其是CD4+T细胞更为显著[11，15]。在SARS-CoV-2感染后，适应性免疫系统的辅助性T细胞、杀伤性T细胞及体液免疫的协同作用对疾病的预后和转归具有重要作用[16]。抗原特异性CD4+T细胞较CD8+T细胞介导的免疫应答对早期的病毒控制更为关键，无症状感染者被发现拥有更多具有功能性的抗原特异性CD4+T细胞[17]，因此与较快的病毒清除和较轻的临床症状密切相关。同时，无症状感染者存在丰富的T细胞受体克隆，以及效应T细胞中干扰素刺激基因、细胞毒活性相关基因等的表达上调也对病毒的控制发挥重要作用[17-18]。本研究还发现，无症状感染者在治疗前后外周血CD4+T细胞计数差值未见明显上升甚至部分患者略有下降，这可能与免疫细胞上鞘氨醇-1及趋化因子受体的表达升高，促进免疫细胞向次级淋巴组织及肺组织迁移有关，从而有利于肺部SARS-CoV-2的清除同时避免严重的免疫炎症损伤[17]。

COVID-19危重型患者常出现免疫的过度激活、细胞因子风暴，表现为血清中多种细胞因子水平的显著增加，如IL-2、IL-6、IP-10、IP-10/CXC-10、MCP-1/CCL-2、GM-CSF、MIP1α/CCL3和TNF-α等[19]。这种过度的免疫反应导致免疫损伤，引起多器官功能障碍甚至衰竭死亡。但无症状感染者的细胞因子表达谱的特点在不同研究中差异较大[20]。本研究共检测34种细胞因子和趋化因子，发现COVID-19患者外周血IL-7和IP-10水平明显升高，且变化趋势随疾病严重程度递增。IL-7的产生相对恒定，其水平主要由T细胞消耗控制，外周血IL-7水平的升高预示着T细胞库的消耗，实质是对淋巴细胞减少产生的负反馈[21]，故重型/危重型患者升高幅度最大。IP-10属于趋化因子CXC家族，可以通过激活机体免疫系统抵抗病毒抑制病毒复制。IP-10在单核巨噬细胞、活化的成纤维细胞、内皮细胞、淋巴细胞等多种免疫细胞表达，具有趋化炎症细胞、促进炎症因子释放、参与机体免疫调节等功能。与既往的研究结果一致，IP-10在COVID-19重型/危重型患者中显著升高，但在无症状感染者中未见明显变化，提示IP-10与COVID-19疾病严重程度相关，是反映疾病进展的一种重要趋化因子[22]。

本研究尚具备一定的局限性，如样本量偏小，尤其是轻症、重症、危重症患者例数较少，可能使研究结果对上述临床分型的代表性下降，同时因随访时间相对较短，未能观察到SARS-COV-2不同分型感染者的远期预后和转归。其次，因传染病标本检测的特殊性，本研究未能进一步对其他免疫细胞亚群（如B细胞、NK细胞、单核细胞等）、活化标记、效应功能等进行检测。上述问题有待于更深入的研究进一步阐明。

综上，COVID-19无症状感染者以青年为主，但未发现与性别因素相关。外周血T细胞亚群计数、细胞因子和趋化因子水平随COVID-19严重程度而变化，但在无症状感染者中未见显著改变，提示COVID-19无症状感染者通过适度的免疫应答实现SARS-CoV-2清除与避免免疫病理损伤的平衡。