杜仲内生真菌多样性研究方法·应用及展望

姚 婷，丁京燕，甘林端端，王 亚，徐源茹，张 娜，佘新松*

(1.黄山学院生命科学与环境学院，安徽黄山 245041；2.安徽农业大学生命科学学院，安徽合肥 230036；3.黄山学院化学化工学院，安徽黄山 245041)

植物内生菌是存在于植物组织内部并与宿主共生的真菌、细菌的统称。这种长期共生过程不仅影响宿主植物的抗逆性、生物活性以及代谢物的积累，也会导致内生菌产生一些与宿主植物相似甚至相同的次生代谢物。如冬虫夏草内生菌中发现了苯甲醛类、环二肽类等冬虫夏草的代谢物；海带和银杏的内生菌中也分别检测到类萜类和黄酮类、抗菌脂肽、球毛壳菌素等宿主的次生代谢产物。借助内生菌可产生宿主相似或相同的次生代谢产物这一特点，以内生真菌为原料开展新药筛选、农药活性物质提取等研发，从而解决以昂贵稀少又难以获取的宿主为原料的难题。相对于内生细菌而言，内生真菌具有分离容易、生长速度快、培育条件低、次生代谢产物较多、后期处理相对方便等优点而成为内生菌的研究重点。

杜仲(Oliv.)起源古老，是我国的第三纪孑遗植物，在《中国植物红皮书-稀有濒危植物》(第一卷)被列入为珍稀濒危第二类的保护树种。自1955年召开的第一次杜仲药理国际研讨会正式公布了杜仲的降低血压研究成果之后，国内外的相关专家相继开展了有关杜仲的大量研究和临床试验。20世纪80—90 年代我国开启了起杜仲消费热潮，杜仲的需求量激增，然而杜仲的生长周期较长，剥皮药用的杜仲则需生长 15～20 年。在市场驱动下大量非理性杜仲剥皮事件时有发生，严重破坏了杜仲资源。

杜仲内生真菌多样性丰富，且不同部位和季节杜仲内生真菌也存在明显差异。同时，研究还发现杜仲内生真菌中含有与杜仲的代谢产物和活性物质一致的多种成分，如丁婷等从杜仲内生真菌发酵液中检测到多糖等与宿主相同的药效成分。杜仲内生真菌还有对多种病原菌有抑菌作用的成分，如王丽丽等分离出的41株杜仲内生真菌中大部分对黄瓜炭疽病、西瓜枯萎病等多种病原菌有拮抗作用，李雅等分离得到的49株杜仲内生真菌，约有45%对苹果腐烂病菌、番茄灰霉病菌等测试菌有抑制作用。

因此，从杜仲资源的开发与保护来看，杜仲内生真菌的合理利用，不仅可以有效地保护杜仲资源，也不影响杜仲药用功能的开发利用。该研究基于现有文献资料，对杜仲内生真菌的多样性进行综述，阐述了杜仲内生真菌的相关研究方法、应用及前景，以期为杜仲内生真菌的研究和开发提供参考。

1 杜仲内生真菌多样性

杜仲内生真菌的种类较为丰富，表1显示杜仲内生真菌共有4门，12纲，21目，26科，40属。属于子囊菌门的内生真菌有33属，占总属数的82.5%，而属于担子菌门、卵菌门和毛霉门的内生真菌分别只有2、1和1属，仅占总属数的5.0%、2.5%和2.5%；属于粪壳菌纲、座囊菌纲、散囊菌纲、锤舌菌纲、丝孢纲和腔孢纲的内生真菌分别有11、8、4、3、3和2属，占总属数的27.5%、20.0%、10.0%、7.5%、7.5%和5.0%，而属于伞菌纲、黑粉菌纲、盘菌纲、茶渍纲、卵菌纲和毛霉菌纲的内生真菌均只有1属，分别仅占总属数的2.5%；属于亚隔孢壳科、从赤壳科、间座壳科、曲霉科和白粉菌科的内生真菌分别有3、2、2、3和2属，占总属数的7.5%、5.0%、5.0%、7.5%和5.0%，而其他的科都只有1个属。总体来看，杜仲内生真菌以子囊菌门为主，以座囊菌纲和粪壳菌纲为优势纲，也有少量为担子门、卵菌门和毛霉门真菌。

表1 杜仲内生真菌的分类Table 1 Classification of endophytic fungi of Eucommia ulmoides

杜仲的不同部位内生真菌在数量和种类存在明显差异，表现出不同部位和器官的内生真菌多样性的异质性。孙微微等和丁婷等从杜仲健康的茎、叶和果实中共分离得到32株内生真菌，3种部位分离菌株数量依次为9、14、9株，在叶部位中真菌分离率最高且种类最丰富。马养民等从杜仲根、茎和叶部位中共分离出62株内生真菌，3种部位分离内生真菌的数量依次为20、21和21株。Sun等从杜仲中共分离内生真菌为307株，其中杜仲叶中仅有12株，而在1～3年枝中共分离发现了295株。

杜仲不同部位内生真菌分离试验结果表明，枝部中内生真菌种数显著多于根、茎、叶和果实等部位的内生真菌。在杜仲内生真菌开发和利用中，需要考虑不同部位的内生真菌多样性的差异，选取特定部分进行分离培养。

杜仲内生真菌的种类和数量在月、季间存在一定的差异性，表现出内生真菌多样性的时序动态特征。杨明琰等在春季和秋季杜仲茎部分别分离得到26株5个属和38株9个属内生真菌，同时秋季杜仲内生真菌数量和种类均高于春季。梁雪娟利用Simpson优势度指数、Shannon多样性指数和 Pielou均匀度指数等指标分析了杜仲皮的内生真菌多样性，结果发现季节对杜仲皮部内生真菌种群影响较大，如头年11月和翌年1月杜仲皮内生真菌种群多样性丰富，且分布较均匀，而3月和7月优势菌群集中，种群较单一。

生境是影响真菌生长、发育的重要因素，不同季节的气候差异较大，从而形成了不同的生境。在季节性生境差异的影响下，杜仲内生真菌的种属和数量也有明显的差异，表现为杜仲内生真菌时序多样性特征。在季节性气候因子中，如最小相对湿度、降雨、平均湿度和平均温度等这些与真菌较为敏感的湿度和温度因子尤其关键。

内生真菌与宿主植物在长期共生演化过程中，通过生物化学作用，使得内生真菌的代谢产物也呈现出一定的多样性。目前已在杜仲内生真菌中检测出多种的具有药用价值的次生代谢产物。如在杜仲树皮部的内生真菌中分离出松脂醇二葡萄糖苷、根茎叶部内生真菌中筛选出黄酮类化合物、松脂醇二葡萄糖苷等多种重要的药用化合物。

龚倩玉等从杜仲内生真菌分离出了吡喃酮类、聚酮类、嘧啶类和苯的衍生物等15种次生代谢物质，以及具有抗菌活性的Azaphilones类化合物。Liu等除从杜仲内生真菌中分离10种已知化合物外，还检测到asperflaloids A和asperflaloids B等2种生物碱。田从丽在杜仲内生真菌中分离得到正丁基-β-D-吡喃果糖苷、甘露醇、啤酒甾醇和麦角甾醇等4个化合物。Liu等从杜仲树皮的青霉()中分离得到conioxepinol C、大黄素、moniliphenone、penicichromanone A和penicichromanone B等5种化合物。Zhang等从杜仲内生真菌(sp.)中分离出了麦角固醇、啤酒甾醇、尿囊素、杀锥曲菌素等9种次生代谢产物。Ma等从分离自杜仲的内生真菌(sp.)中分离得到烟曲霉毒素B、烟曲霉素C、麦角甾醇、啤酒甾醇等。

杜仲内生真菌除了部位、时序和代谢产物多样性外，杜仲内生真菌多样性还受到采集地域、杜仲生长年龄、培育方式等因素的影响。

2 杜仲内生真菌研究方法

利用微生物的抗菌作用和抑菌作用是病虫害生物防治的重点方向之一。利用杜仲内生真菌的抗菌和抑菌作用，在筛选抗菌作用和抑菌效果明显的菌株，是近年来对杜仲内生真菌资源进行的开发利用的方向之一。目前，较为常用的杜仲抗菌型内生真菌的筛选方案和步骤主要有以下两类：

(1)分离和纯化→菌株筛选→分子鉴定。分离采用组织分离法，纯化采用尖端菌丝挑取法，菌株筛选采用平板对峙法做生防菌和病原菌间的拮抗试验，分子鉴定以CTAB法提取菌株基因组DNA，获取ITS序列，经对比、分析和鉴定，最后确定具有抗菌作用的目标菌株。

(2)分离和纯化→形态学鉴定→次生代谢产物提取→抑菌试验。杜仲内生真菌的形态学鉴定主要参照《真菌鉴定手册》，可采用光学显微镜技术、扫描电镜技术或透射电子显微镜技术，依据真菌的形态、理化性能及超微特征等表型特征进行初步分类。

光学显微镜技术是根据内生真菌在PDA培养基的生长速度、大小、菌落纹饰、质地、边缘等培养特征进行分类，一般将菌丝用透明胶带粘贴，镜检观察其分生孢子梗和孢子的形态及大小等显微特征。

扫描电镜技术是采用插片法培养菌株，待菌丝长满玻面后取出，在缓冲液中戊二醛固定样品超过4 h，3次洗涤，四氧化锇再固定1 h，3次洗涤。样品通过设置梯级浓度的乙醇脱水15～20 min，转移到乙醇和乙酸异戊酯的混合液约0.5 h，再经纯乙酸异戊酯浸泡1 h后干燥，样品表面涂金，扫描显微镜观察，可清晰地分辨出真菌的菌丝、大分生孢子和小分生孢子。

透射电子显微镜技术是在培养皿中依次铺滤纸和铜网膜，注入无菌水，滴入火棉胶液(2 g火棉胶/100 mL醋酸异戊酣)，薄膜形成后吸管在吸干培养皿的边缘处水分，至薄膜贴紧铜网止，室温干燥毛细管吸取菌液并滴在铜网上，透射电子显微镜下观察或摄影。

抑菌试验采用菌饼法测定活菌活性、纸片扩散法(活菌测试)测定代谢产物活性(代谢物测试)。

总体来看，基于电镜等先进设备进行的形态学鉴定，在杜仲内生真菌的筛选上尽管试验步骤较为复杂，但筛选的结果更为精确。随着先进的技术设备在真菌筛选上的应用，杜仲内生真菌的分离、筛选的分辨率将不断提高。

3 杜仲内生真菌的应用

杜仲化学成分丰富，主要有木脂素类、环烯醚萜类、酚类、甾类、萜类、多糖类、杜仲胶等，具有心血管保护、抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、免疫调节等保健作用，且应用价值高，有着生态价值、饲用价值、食用价值和工业价值等。随着杜仲的化学成分和药理活性研究的逐步深入，其应用日益广泛且市场需求也随之增大，因此寻找替代物刻不容缓，这让杜仲内生真菌具有广阔的发展前景。

杜仲内生真菌的培养可起到代替药用植物的作用，在医疗上有着可观的应用潜力。Chen等利用液相色谱-质谱联用技术，发现了杜仲内生真菌产生了相关的绿原酸和京尼平苷成分，并认为杜仲内生真菌有利于发酵生产绿原酸这一重要活性成分。刘超等从杜仲树皮的内生真菌中提取到了松脂醇二葡萄糖，表明杜仲内生真菌在生产松脂醇二葡萄糖有一定的开发前景。程浩等以1株杜仲内生真菌为研究对象，利用单因素试验和响应面试验优化了发酵松脂醇二葡萄糖苷工艺条件，为其规模化生产提供了重要参考。Wu等对杜仲降压成分京尼平苷和京尼平苷酸的提取工艺做出比较，得出半仿生提取法为最佳方案，有利于进行高效及大规模生产。岑娟等将杜仲产生的多糖成分进行体外细胞毒活性筛选，发现其对部分肿瘤细胞有着一定的细胞毒作用。Zhang等从杜仲的内生真菌ER16-5中分离出7种胶霉毒素类似物，其中胶霉毒素和脱氢胶霉毒素显示强大的抗菌性，表明该菌株是前景极好的抗菌次生代谢产物来源。

近年来，普通农药被广泛使用于农作物的病虫害，造成了环境污染及蔬菜水果的农药残留问题，相比之下，杜仲内生真菌的应用在农业的生物防治方面有着更加积极的作用。丁婷等分离出1株杜仲内生真菌DZGS08，对玉米纹枯病菌生长抑制率达到了50.44%。孙微微等从杜仲中分离出内生真菌 DZGS07，对苹果炭疽菌处理后的第7天的防效高达84.19%，有着较好的生防潜力。丁婷等将具有较好抑菌活性的杜仲内生真菌的抗性突变株株 DZJ07-2定植在小麦根际，提高了小麦根部3种防御酶的活性，使得小麦对纹枯病的抗性得到一定程度上的提高。

4 展望

在杜仲资源有限而市场需求持续增加的背景下，科学开发和有效利用杜仲内生真菌资源将是当下杜仲资源研究的重点方向。杜仲内生真菌多样性不仅提供了大量可用于新药筛选、开发的微生物资源，且其代谢物也可用于药物开发和筛选抗菌菌株，显示其在药物研发和生防上具有巨大潜力和应用前景。尽管前期在杜仲内生真菌领域开展了大量的研究，也取得了诸多研究进展，但依旧存在以下问题亟待解决。第一，杜仲内生真菌的分离与鉴定方法缺乏统一的标准和规范，研究结果的可比性差，需要进一步开展杜仲内生真菌的分离、鉴定方法优化的研究；第二，内生真菌的代谢产物与杜仲之间的内在关联研究较少，特别是杜仲-内生真菌-代谢产物之间信号传递和响应机制等机理研究有待深入；第三，影响杜仲内生真菌多样性的因素复杂，对宏观环境要素、微观生境、生长期、组织器官的部位等诸多因素的贡献还有待明确；第四，杜仲内生真菌在医疗制药和农业生物防治方面的应用缺乏实践，距离大规模工业化生产还很远；第五，杜仲胶在工业橡胶上有着巨大的应用市场，利用内生真菌促进杜仲的产胶率和提取率也是值得探索的方向。