超高效液相色谱法测定贻贝中苯和二甲苯的代谢物

胡芬静，彭虹晖，廖思扬，宋立玲，傅谧妮，周秀锦*

(1.舟山海关综合技术服务中心，浙江舟山 316000；2.舟山福来聚食品有限公司，浙江舟山 316000；3.中华人民共和国杭州海关，浙江杭州 310007)

苯系物作为有机溶剂和稀释剂的主要成分，已被广泛应用于单独和混合物中其他化学品的合成。已有的研究表明，苯系物多存在于海水和沉积物中，由于其生物降解时间长，对海洋生态系统造成长期和较大的危害。紫贻贝因营养丰富、肉质鲜美且繁殖速度很快，目前已经成为主要海水养殖经济贝类之一。贻贝是典型的滤食性双壳贝类，代谢率较低，被广泛用于全球海洋污染的生物监测中。N-Acetyl-S-(phenyl)-l-cysteine(PMA)因其半衰期较长，和反，反-粘康酸(，-Muconic acid，MU)均为有效和敏感的苯代谢标志物。二甲苯3种同分异构体在人体内被氧化成-、-和-甲苯酸，然后与甘氨酸结合，以-、-和-甲基硫尿酸的形式在尿液中排泄。甲基硫尿酸作为生物标记物研究二甲苯与暴露水平的相关性。

苯和二甲苯代谢物的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)、高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱联用(HPLC-TOF/MS)等，但研究对象大多是尿液、土壤、牙齿等基质，前处理方法有直接离心处理、液液萃取和固相萃取等方法。但是目前鲜见贻贝样品中苯和二甲苯代谢物的研究报道，该研究贻贝样品采取盐酸酸化、乙酸乙酯提取、氯化钠防止乳化、正己烷脱脂等前处理方法，结合超高效液相色谱技术，建立适合贻贝中苯和二甲苯代谢物的二级管阵列检测器-超高效液相色谱(PAD-UPHC)检测方法，并应用于东海沿岸贻贝中苯和二甲苯代谢物的检测。

1 材料与方法

SHIMADZU Nexera X2 Lc-30A液相色谱仪配二极管检测器(日本SHIMADZU公司)；XS105 分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；ST-16R 型高速冷冻离心机(美国Thermo 公司)；氮吹仪(美国Organomation公司)；乙腈、甲醇、甲酸、正己烷(色谱纯，美国Sigma-Aldrich 公司)；2-甲基马尿酸(2-MHA)、3-甲基马尿酸(3-MHA)、 4-甲基马尿酸(4-MHA)、N-Acetyl-S-(phenyl)-l-cysteine(PMA)、反，反-粘康酸(MU)标准品(美国Sigma Chemicals；St.Louis，MO.)；盐酸、氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

取5.0 g样品于50 mL离心管，加10 mL 0.2 mol/L盐酸溶液和2.0 g氯化钠，用均质器以1 000 r/min均质1 min，20 mL乙酸乙酯提取，超声5 min，漩涡混合30 s后，4 ℃、9 000 r/min离心5 min，收集乙酸乙酯层，残留物再用15 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯。收集液在40 ℃下旋转蒸发浓缩近干，残渣用1.0 mL流动相溶解，再用3.0 mL乙腈饱和的正己烷脱脂2次，下层液体过0.22 μm微孔滤膜后，待测。

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC® HSS T3 C色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，进样盘温度4 ℃，柱温40 ℃，进样量2.0 μL。流动相A相为15 mmol/L 乙酸铵，B相为甲醇；流速0.2 mL/min，检测波长为235 nm，流动相梯度洗脱如表1所示。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

在空白贻贝中加入系列浓度的苯和二甲苯代谢物混合标准溶液，混匀后按“.”和“.”进行样品前处理和检测，以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线，外标法定量。

2 结果与分析

苯和二甲苯代谢物属于含有羧基的有机酸类物质，为获得较高的重现性和分离效果，流动相中加入一定的酸可以抑制羧基解离，该研究选取0.1%乙酸-甲醇、15 mmol/L 乙酸铵-甲醇和15 mmol/L 乙酸铵(0.1%乙酸)-甲醇为流动相，梯度洗脱，其中用0.1%乙酸-甲醇为流动相时，4-MHA和3-MHA分离度不理想；用15 mmol/L 乙酸铵(0.1%乙酸)-甲醇作为流动相，4-MHA和3-MHA峰型拖尾现象明显；选择15 mmol/L乙酸铵-甲醇为流动相，梯度洗脱，目标物色谱峰形尖锐对称。二甲苯代谢物在反相色谱柱及极性流动相中的分离和保留效果较好。考察Waters ACQUITY UPLC CSH TM C色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C色谱柱(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC® BEH C色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，最后选择了分离度更好的Waters ACQUITY UPLC® HSS T3 C色谱柱，在15 mmol/L 乙酸铵-甲醇溶液流动相体系下，可以实现4-MHA和3-MHA分离，5 种目标物的分离效果见图1。

图1 5种苯和二甲苯代谢物的标准溶液色谱图Fig.1 Chromatograms of the five metabolites of benzene and xylene standard solution

贝类样品含有丰富的蛋白质、磷脂、分泌黏液、色素等杂质，基质较为复杂，常用提取净化方法多为液液萃取。该研究考察了乙酸乙酯、二氯甲烷-异丙醇(5∶1)、三氯甲烷-异丙醇(5∶1)3种提取液的萃取效率，结果表明3种提取液的提取效率没有明显差别，但是二氯甲烷-异丙醇(5∶1)和三氯甲烷-异丙醇(5∶1)提取液中含有色素基质相对较多，而乙酸乙酯提取时会出现乳化现象。该研究以乙酸乙酯为提取液，优化了提取方法，为防止乳化现象，加入2.0 g氯化钠，不仅有效防止了乳化现象的发生，且在均质时最大化地分散了贝类样品，增大了样品和乙酸乙酯的接触效果，提高了乙酸乙酯的萃取效率。最后采用正己烷液液分层净化，有效消除了样品中脂肪的干扰，最终贻贝样品前处理后二甲苯代谢物回收率为85.8%～110.6%。

在优化条件下，采用贻贝样品基质加标绘制标准工作曲线，以峰面积对相应质量浓度进行回归分析，5种苯和二甲苯代谢物在各自线性范围内呈良好的线性关系(>0.99)；以3倍信噪比为基准，得到5种化合物的方法检出限(LOD)，以10倍信噪比为基准，得到方法定量限(LOQ)。具体见表2。

表2 苯和二甲苯代谢物的线性方程、决定系数、LOD和LOQTable 2 Linear equation，determination coefficient，LOD and LOQ of the metabolites of benzene and xylene

为验证方法的准确度，在空白贻贝样品中添加高、中、低 3个不同浓度的苯和二甲苯代谢物进行加标回收试验，按“.”和“.”条件检测，每一浓度平行测定7次。结果发现(表3)，5种苯和二甲苯代谢物的平均回收率为83.40%～113.10%，相对标准偏差(RSD)不大于8.62%。

随机购买舟山各菜场的贻贝样品，采用该方法，检测了东海海域贻贝共45个样品中苯和二甲苯代谢物含量，显示45批贻贝样品中均未检测到苯和二甲苯代谢物，结果表明舟山地区贻贝质量相对安全。

表3 苯和二甲苯代谢物的平均回收率和RSDTable 3 Average recovery rate and RSD of the metabolites of benzene and xylene

3 结论

该研究建立了贻贝中5种苯和二甲苯代谢物的二极管阵列检测器-超高效液相色谱分析测定方法，结果表明该方法的线性、灵敏度、检出限和回收率等技术指标均满足检测方法的要求。5种苯和二甲苯代谢物的回收率在83.40%～113.10%，相对标准偏差(RSD)不大于8.62%，分离效果和重复性好，应用该方法对本地区的贻贝样品进行了分析，未发现贻贝样品中含有苯和二甲苯代谢物。