成组毒理学分析仪在污染物识别与毒性测试中的应用

杨晓溪，李姿慷，郭云鹤，刘艳娜，王 易，聂 童，周群芳，史建波，曲广波，江桂斌

（中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京 100085）

随着工业的快速发展和科技的飞速进步，每年新合成的化学品不断涌现，但受到监管的化学品十分有限，进入环境中的潜在污染物数量以惊人的速度迅猛增加。环境污染被认为是当今世界诱发人类疾病甚至导致死亡的重要因素［1］，我国环境污染所导致的健康问题也已突显［2］。化学品随着人们的生产生活释放到各类环境介质或食品中，种类繁多，复杂多变，一些化学品可在极低浓度下产生毒性，而一些本无毒性的物质可与其他化合物协同发挥更强的毒性作用，呈现出复合毒性效应［3］。此外，化学品在复杂介质中的迁移转化会产生各类转化产物，其毒性作用可能强于母体化合物［4］，提示着更多不可预测的风险。

现有的污染物分析方法利用液相色谱-质谱或气相色谱-质谱联用等技术仅针对已知目标化合物进行检测，再基于浓度预测其毒性效应，但忽略了大量的非目标化合物或未知化学品，难以反映复杂体系中所有化合物的实际效应［5］。利用活体动物或离体细胞的生物效应检测方法可以直接评估样品的毒性，但较低的通量和较差的可重复性使得该方法无法适用于大规模样品的筛选。为了运用更有效的方法预测化学品对人类健康及环境的影响，美国于2007年提出了Tox21计划，美国环境保护署（EPA）、国家毒理学计划（NTP）、国立卫生研究院（NIH）以及食品和药物管理局（FDA）形成了Tox21联盟，搭建了基于百余种离体细胞测试的高通量自动化毒性检测平台，建立了涵盖工业化学品、消费品、食品添加剂等在内的上万种化合物的毒性数据库［6-7］。然而，Tox21筛选平台仅限于纯化学品的检测，无法对未知化合物和实际环境样品进行评价，不能反映复杂基质中化学品的实际毒性与健康危害。

面对我国严峻的环境与食品安全问题，为突破实际样品中毒性物质快速识别的瓶颈，本课题组于2005年首次在国际上提出了“成组毒理学”（Integrated toxicology）的概念，并研制出第一代“成组毒理学分析仪”（Integrated toxicology analyzer，ITA），于2013年获得国家发明专利授权［8］。该仪器通过固相萃取、高效液相色谱、四极杆串联质谱、加样装置的在线联用，可完成样品自动分离、组分收集与分析、毒性测试三部分复杂的操作，适用于实际环境样品中效应污染物的筛选。

近年来，随着质谱技术、机械自动化、大数据分析及人工智能的高速发展，本课题组于2016年开始研制第三代成组毒理学分析仪—高通量多功能成组毒理学分析系统，从设备先进性、规模配置及功能设计等方面进行升级改造，旨在实现全面自动化、高通量的快速检测与筛选，于2020年获得国家发明专利授权［9］。该系统发展了自动化、高通量、简便快捷的样品分离与制备技术，构建了复杂介质样品的分离与制备子系统，实现了复杂介质样品中效应组分的自动提取、富集、纯化、收集及规模化制备；发展了无机物、有机物、细颗粒物的分析与鉴定技术，构建了由质谱、光谱等仪器分析模块与结构-性质关系信息库组成的综合鉴定系统，实现了复杂样品中未知污染物、毒性效应物的自动多维分离、定量及鉴定；构建了以生物有效性、细胞生物学效应和生物靶分子3个层次的多靶点高通量毒性评价模块，建立了污染物的内分泌干扰效应、神经毒理学效应、血液毒性效应等多靶点毒性评价方法，实现了样品的高通量多靶点自动化毒性评价；发展了in silico污染物健康危害高通量筛查评价方法，实现了不良健康结局的优先级排序，为污染物健康影响评价提供理论和方法储备，并建立了基于计算模拟的污染物体内潜在靶点筛查方法和计算模块，整合于高通量成组毒理学数据一体化分析平台。高通量多功能成组毒理学分析系统结合最先进的化学分析与现代毒理学评价方法，可高通量完成实际复杂样品中效应污染物的结构解析、识别与毒性评价，显著提高了污染物识别及毒性评价的可靠性及效率，为未知污染物的筛选及复合效应等研究提供了全新的技术手段和通用平台。本文主要总结了成组毒理学分析仪的结构与设计，以及该仪器在复杂样品中污染物分离与制备、污染物检测与鉴定、生物毒性效应高通量筛查、实际样品中效应污染物识别方面的应用进展，并对其未来的发展趋势和应用前景进行了展望。

1 成组毒理学分析仪的结构与设计

第二代成组毒理学分析仪即高通量多功能成组毒理学分析系统涵盖了多个功能区，包含复杂介质样品的高通量分离与制备、有毒物质的仪器分析与结构-性质关系综合鉴定、多靶点高通量生物效应评价、仪器控制及数据综合分析4个子系统。通过各子系统功能间的耦合，可实现复杂介质样品中效应组分的自动提取、富集、纯化、收集及规模化制备，未知污染物的自动化多维分离、定量及定性分析，高通量多靶点自动化毒性检测以及数据一体化解析。

复杂介质样品高通量分离与制备子系统由样品制备、样品分离和样品收集三部分组成，分别对样品进行提取、净化、浓缩，基于色谱柱的组分分离以及馏分自动化收集。该子系统主要原理涵盖机械臂定位、进样环定量、进样阀切换、色谱分离及自动化软件控制，样品经自动化提取后，机械臂将样品转移至净化浓缩模块，净化浓缩后的样品直接经管道进入色谱分离系统进行组分的制备，通过进样阀比例的调节，组分分别进入高分辨质谱完成污染物的鉴定，进入馏分收集系统完成组分的自动收集。有毒物质的仪器分析与结构-性质关系综合鉴定子系统包括可用于有机物定量和定性分析的高分辨液相色谱-质谱、气相色谱-质谱，以及自主研制的质子转移反应质谱，用于无机物如金属元素和甲基汞快速测定的检测仪。经分离制备子系统处理得到的样品或组分通过综合鉴定子系统的相应检测仪器完成测定后，结合测试结果并调用仪器控制及数据综合分析子系统中的结构-性质关系信息库模块，完成污染物的快速鉴定。多靶点高通量生物效应评价子系统由生物有效性、细胞效应及分子效应检测3个模块组成，分别为通过检测细胞生存力及跨膜电阻评价化合物穿透力的人Caco-2细胞的肠上皮生物屏障模型，通过检测细胞增殖分化、凋亡、特征酶活性及受体转录活性的多种离体细胞高通量测试模型，以及通过检测功能基因及蛋白的高通量DNA羟甲基化测序方法及DNA损伤产物的电化学发光检测装置。该子系统通过整合多种自动化细胞培养设备、全自动机械臂等，可高通量快速完成各模块的全流程自动化测试。仪器控制及数据综合分析子系统是以多维滑轨机械臂为核心的自动控制系统，通过建立化学品结构与性质关系数据管理体系、关键分子起始事件虚拟筛选技术及基于体外与生物信息学数据的有害结局通路解析方法，实现全流程数据采集、汇总与分析，通过结构与数据挖掘的信息和决策技术，完成数据一体化分析。

成组毒理学分析仪以自动化控制与高通量筛选为核心，形成了功能强大的有机整体，其主要工作流程如图1所示。复杂样品（如细颗粒物、土壤、底泥、药物、生物样品等）经前处理系统进行初步提取与净化后，进行基于离体生物实验的多靶点毒性效应快速筛查和基于静电场轨道阱高分辨质谱的有毒物质快速鉴定，对于效应样品进行进一步分离与纯化，解析关键活性组分或未知化合物的结构特征。利用该系统，不仅可同时完成针对大规模样品的化学分析与毒性检测的联动测试，也可进行单一化学分析或生物学效应高通量筛查，其作用和功能覆盖了化学分析与毒理学研究中的多个层面。ITA可在短时间内获取化合物的毒性、含量及结构特征，为环境化学与毒理学研究领域提供了强有力的技术手段和通用平台，可满足我国环境保护、食品安全、药物成分解析、军事毒物分析等应急需求。

图1 成组毒理学分析仪工作流程Fig．1 The workflow of integrated toxicology analyzer

2 污染物识别与毒性测试方法的开发与应用

2.1 在复杂样品中污染物分离与制备方面的应用

环境、食品和生物样品中污染物种类繁多、性质各异，一些有机污染物的浓度很低，因此建立复杂样品中不同污染物的快速提取、净化、分离方法对实现大量样品的高通量分析与检测极为重要。已有的样品前处理及制备技术仅利用独立的仪器或容器进行样品中特定性质污染物的处理，操作复杂、耗时长、重复性差，且无法进行痕量物质的高效提取［5］。ITA中高通量分离与制备系统解决了复杂介质样品提取与制备的难题，利用该系统，通过样品分级提取、组分收集、色谱分离纯化及细颗粒物分离纯化，即可完成不同样品的快速提取与组分的制备。

ITA整合了加速溶剂萃取仪、全能样品前处理平台、机械臂等自动化设备，通过硬件连接和软件控制结合的方式，开发了适用于复杂样品中目标有机污染物的自动化提取与制备技术。对于固体、半固体样品的处理，采用快速溶剂萃取仪完成对污染物的提取。全能样品前处理平台集成了凝胶净化、固相萃取、定量浓缩和液相进样4个功能模块，可独立完成液体样品中有机物的提取、富集和浓缩。完成提取、净化及浓缩的样品，经色谱柱分离后，分别进入质谱仪及收集器，可快速用于后续各馏分化学检测与生物效应评价的并行分析，节省了样品处理时间并提高了效率。

细颗粒物样品不仅附着了各类金属、有机物，且一些超细颗粒物可进入人体从而产生健康危害，针对细颗粒物样品的分离纯化是深入研究其环境效应及生物安全性的前提。在ITA系统中，中科院生态环境研究中心的谭志强等［10］利用中空纤维膜流场流分离技术自主研制了细颗粒物的在线多维分离纯化模块，通过与紫外吸收光谱检测器和电感耦合等离子发射光谱的在线联用，可进行不溶态颗粒粒径表征及颗粒上附着的可溶性金属的定量测定。利用该装置，针对在超纯水、模拟天然水和模拟肺液中孵育的实际大气细颗粒物样品，进行可溶性金属及残余细颗粒物的分离纯化，并对其溶出率及数量进行测定，发现锌在模拟肺液中的溶出率最高，而尺寸小于10 nm的细颗粒物在模拟肺液中检出的数量最多。该装置可快速有效地分离纯化可溶性金属组分及小粒径的细颗粒物，在实时监测并追踪大气细颗粒物在环境与生物介质中的转化方面具有潜在的应用前景。

2.2 在污染物检测与鉴定方面的应用

复杂样品中未知污染物的结构鉴定往往需借助多种仪器和技术完成，对于未知化合物，除了质谱分析结果，还需利用紫外、红外等多种光谱技术以及核磁共振波谱技术分别对馏分中化合物的官能团以及分子骨架进行分析，以推测结构。ITA整合了超高分辨率、超高质量准确度的全扫描型高分辨质谱仪，辅以光谱分析模块，结合数据分析软件，可实现样品或组分中新型未知污染物的高通量快速识别。

在新污染物鉴定方面，本课题组阮挺等［11］对20个省份和自治区共56个不同污水处理厂的污泥样本中新型氯代多氟醚基磺酸盐类物质（Cl-PFESAs）进行疑似靶标筛查，发现了3种Cl-PFESAs同系物，即6∶2 Cl-PFESA、8∶2 Cl-PFESA和10∶2 Cl-PFESA，其检出率分别为100%、89．3%、23．2%，污泥中化合物含量范围为未检出~209 ng/g（干重）。其中6∶2 Cl-PFESA为最主要的Cl-PFESAs污染物，其几何平均浓度为2．15 ng/g，在部分地区污泥样本中的浓度已超过全氟辛烷磺酸盐（PFOS），成为主要的全氟化合物污染物。进而对6∶2 Cl-PFESA在体外超还原态氰钴胺厌氧体系中可能的转化产物进行非靶标分析，筛查出3个脱卤加氢还原转化产物，即1H-6∶2 PFESA、2H-6∶2 PFESA和1H-6∶2 PFUESA，进一步在真实河流底泥样品中发现了其转化产物［12］。在污染物转化方面，本课题组张青等［13］采用2，4，6-三溴苯酚对水稻进行了水培暴露，通过可能的代谢途径建立本地的代谢物数据库，结合气相色谱和高效液相色谱-高分辨质谱，鉴定了40种Ⅰ相和Ⅱ相代谢物，为系统了解溴苯酚的迁移转化及其环境健康风险评估提供了重要参考。同时，本课题组陈伟芳等［14］利用基于成对质谱碎片质量差的方法，在水稻细胞中鉴定出65种新型短链和中链氯化石蜡代谢物，并揭示了其在悬浮水稻细胞中的代谢分子网络，首次发现了氯化石蜡的羟基化、硫化和糖基化过程。

在有机气体检测方法方面，中科院生态环境研究中心束继年课题组［15］通过单光子过程研究、质子来源研究、激发态二氯甲烷诱导的高效质子化过程机理推导，揭示了激发态二氯甲烷诱导的质子转移离子化机理，以此研制了新型电离方法。基于研制的新型离子源，研究人员开展了常见爆炸物如硝基化合物的高灵敏检测研究［16］，该方法对芳香族硝基化合物具有超高的电离效率，对空气中硝基苯化合物的检测具有重要应用价值。利用新离子化技术，可在呼出气体中检测疾病相关的生物标志物如丙烯醛等［17］，实时监测有机胺类物质［18］，检测有机磷类神经毒剂等［19］。该方法应用范围广，实用性强，有望为各类复杂样品中挥发性有机物化学成分的鉴别及含量测定提供技术支撑。

2.3 在生物毒性效应高通量筛查方面的应用

复杂介质样品中存在多种化合物，其毒性效应各异，在机体内的代谢及生物有效性尚不明确，而针对其中种类繁多的未知污染物的毒性筛选工作相当繁重，时间、人力、财力消耗巨大。然而，目前国际上现有的毒理效应筛选平台仅限于纯化学品的检测，且在效应重组细胞及分子传感器上存在缺陷，无法进行复杂基质及未知化合物的高通量筛选与毒性评估。ITA中多靶点高通量生物效应评价子系统是以离体生物学测试为核心的自动化毒性测试模块，适用于样品、组分或化学纯品的各类毒性效应高通量筛查研究。

四溴双酚A（TBBPA）及其衍生物是一类新型溴代阻燃剂，广泛用于电子电器产品、油漆、纺织品等日用品。这类物质的大量使用，不可避免地使其随着人们的生产生活进入到环境中，对人类造成威胁。本课题组曲广波等［20］利用ITA平台中多靶点毒性筛查技术，基于T-screen方法研究了TBBPA衍生物及其环境转化产物对TR信号通路的潜在干扰效应，结果表明，这些化合物可能会与甲状腺激素转运蛋白结合从而干扰甲状腺激素水平，也可能会进入细胞与甲状腺激素受体TR作用，干扰相关基因调控从而引起甲状腺激素干扰效应。与TBBPA衍生物相比，其环境转化产物更易进入细胞而发挥甲状腺激素干扰作用。该研究可为TBBPA衍生物及其环境转化产物的健康风险评估提供科学依据，也提示人们其环境转化产物可能带来的潜在威胁。

由新冠病毒SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）已遍及全球，越来越多的研究关注其感染的相关因素。血管紧张素转化酶2（ACE2）被确定为SARS-CoV-2的功能受体，其转录水平与SARS-CoV-2易感性和COVID-19症状的严重程度呈正相关。ACE2转录水平受遗传因素和非遗传因素的调控，作为非遗传因素的外源化学品暴露对病毒受体的表达影响尚不明确。利用ITA平台，本课题组曲广波等［21］基于多种细胞系建立了病毒受体转录表达的高通量检测方法，针对环境中常见的60种化学污染物进行筛选，发现部分污染物如铅以及大气细颗粒会导致ACE2转录水平显著上调（如图2所示），最高表达量可达到对照组的7倍。该研究揭示了外源性化合物暴露可能通过共同的关键调控因子影响病毒受体的转录，从而增加病毒感染的可能性，为研究外源化合物暴露与病毒易感性和有害结局路径之间的联系提供了初步线索。

图2 不同化学品暴露对病毒受体转录水平的影响［18］Fig．2 Expressions of virus receptors in HEK-293T cells stimulated by nongenetic external chemicals［18］

2.4 在实际样品中效应物质识别方面的应用

识别实际样品中的效应物质是污染物环境风险评估及污染物控制的重要步骤，单一的化学分析或毒性测试难以反映实际样品的效应。效应导向分析（Effect-directed analysis，EDA）是以生物效应为核心，通过组分分离及化学分析实现复杂环境样品中贡献污染物的有效识别方法［22-23］。该方法从样品的生物效应入手，仅针对活性样品进行组分分离及结构鉴定，很大程度上降低了样品的复杂性并缩小了筛选范围，可直接快速地锁定毒性贡献化合物［24-25］。

利用EDA思路，基于第一代ITA系统，本课题组［26］建立了基于大鼠小脑颗粒神经元细胞（CGNs）原代培养方法，通过毒物或样品对CGNs暴露进行毒性评价，建立了神经毒性效应引导的复合污染物毒性筛查新方法，进而应用非靶标有机质谱技术，对某化工厂附近的实际环境样品进行测定，在活性组分中鉴定出1种潜在的新型有机污染物—四溴双酚A双丙烯基醚（TBBPA-BAE）。基于TBBPA-BAE的毒性当量和化学浓度，发现其在样品中的浓度可以解释实测发育神经毒性的86%，表明该物质是诱发潜在神经毒性风险的主要效应污染物。该研究为实际样品中效应物质的识别奠定了坚实的理论和技术基础。

基于ITA平台，本课题组［27］进一步利用EDA技术对广东贵屿地区电子垃圾拆解地附近底泥中的雌激素效应污染物进行了筛查。通过体外MVLN细胞荧光素酶报告基因体系对样品进行雌激素效应初筛，针对效应样品，利用反相制备色谱进行组分的分离与制备，对所有组分进行雌激素效应检测后筛选出活性组分，通过高分辨质谱靶向和非靶向结构识别，发现了双酚A、己烯雌酚等7种物质为雌激素效应贡献物，并对其污染来源及迁移规律进行了解析。同时，本课题组［28］使用效应导向分析策略鉴定了样品中的多环芳烃受体激动剂，选取小鼠肝癌细胞系CBG2．8D报告基因检测法用于毒性的定量及毒性效力的测定，采用正相制备色谱对效应样品进行组分分离，以降低样品中化合物的复杂程度。借助气相色谱-高分辨质谱技术，结合毒理学数据库比对，筛选并最终确定23种化学物质为样品中的多环芳烃受体激动剂，其中二至五环的多环芳烃化合物是样品中毒性效应的主要来源。上述两项研究均通过效应导向分析策略揭示了电子垃圾拆解地区相关的毒性效应因果化学物质，为特征污染地区效应化学品的监控提供了重要的科学数据和应用参考。

2.5 在环境分析与毒性检测产业化及合作研究方面的应用

基于成组毒理学分析仪的概念，本课题组提出了集约型自动化小型机的创新思路与技术设计，拟研制不同样品的特异毒性化学物质筛选与识别个性化系统，面向环境保护及监测、食品安全、军事毒物分析等领域的不同检测需求，实现该小型化系统的个性化定制并积极推动其产业化应用。利用ITA系统，本课题组在样品检测与应用方面与各研究机构或企业合作开展了样品中有毒物质识别及特定毒性测试技术开发等研究，例如，与国内知名企业合作开展了产品中毒性化学品的筛查与识别研究，与军事医学研究机构合作开展有毒化学品的风险快速评估等工作。成组毒理学分析平台可用于各类环境风险、污染物筛选识别、食品安全、生物样品、中药试剂、化学品评估等复杂样品的联合研究。

3 总结与展望

成组毒理学分析仪是国际上首台可用于实际样品分析测试与毒性筛查的综合平台，可自动化完成样品前处理、组分分离与制备、多靶点毒性测试及效应物质结构识别与鉴定，显著提高了污染物识别及毒性评价的可靠性和效率，将大大推动我国环境科学与毒理健康基础研究的水平。为发挥其优势，展现其在环境与健康研究、食品安全、军事及国家安全等领域的巨大应用潜能，将从以下方面进行改进并推动其应用：

（1）特异响应细胞的构建及类器官毒性测试模型的建立。利用报告基因生物检测技术或基因编辑技术，针对毒理学研究新兴领域，构建化合物特异效应检测细胞株和类器官毒性评价模型，并运用于高通量自动化检测平台，为快速筛查复杂样品中健康风险物质提供有效的生物效应测试手段。

（2）新污染物筛查方法的开发及数据库的建立。结合多种质谱技术，发展适用于不同化合物类型的高灵敏识别与鉴定方法，以提高污染物发现效率。基于新污染物的特征质谱信息，建立标准化污染物指纹数据库，以适用于我国新型污染物的筛查研究。

（3）筛选通量的拓展及灵敏度的提高。基于已建立或正在开发的样品分离与制备及毒性测试方法，拓展制备及测试通量，实现384或1 536微孔板的快速高通量测试。在拓展通量的同时，通过改进优化关键技术，提高毒性筛选的灵敏度，以适用于复杂介质中低剂量有毒物质的毒性效应检测。

（4）全流程标准化方法的建立及产业化应用。根据国家标准及测试法规，建立样品全流程自动化提取、制备、毒性测试及结构鉴定的标准化方法，并获得国家级认证资质，以应用于工业化学品、中药或合成药物、食品、军事毒物、突发事件毒物检测等领域，建立成高效快速的测试平台。