不同来源生物炭浸提液对辣椒种子萌发与幼苗生长的毒理效应

李 莹，刘兰英，何肖云，邱胤辉，黄锐敏，傅建炜*

(1.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/福建省农产品质量安全重点实验室，福建 福州 350003； 2. 福建三明市农业科学研究院， 福建 三明 365000)

生物炭是由生物质在高温限氧条件下，经热解炭化所形成的含碳量较高且高度芳香化的固体产物[1]。前期诸多研究证实，通过将生物炭还田不仅可以加强碳固存，缓解温室效应，而且能够改善土壤质量[2]，提高作物产量[3]；同时，生物炭具有丰富的孔隙结构和较强的吸附能力，也常被用于污染土壤的修复[4]。因此，近年来生物炭在土壤中的应用日益受到重视，现已成为环境和农业科学领域的研究热点之一。然而，目前使用的生物炭多由农业和林业的残留物[2]、污泥[5]等物质热解而成，可能含有潜在的浓缩有毒成分，特别是重金属、多环芳烃(PAHs)和挥发性有机物等毒性化合物[6-7]，会对植物产生毒性效应[7-8]。由于土壤施用是一个不可逆过程，生物炭中有毒成分的存在可能会对土壤环境带来潜在的威胁，或被植物吸收而进入农产品，最终危及人类健康。因此，在利用生物炭进行大规模的土壤优化和修复前，有必要对生物炭的安全性进行评估。

种子的萌发率和幼苗早期生长对植物后期生长发育至关重要，也很大程度决定着作物的产量[9]，基于此，本研究通过测定不同生物炭浸提液处理下辣椒种子萌发和幼苗生长情况，探讨生物炭对辣椒植株抗氧化酶活性和MDA含量的影响，以阐明生物炭对辣椒植株的潜在危害，客观地评估辣椒幼苗对生物炭应用的反应，为后期进一步利用生物炭对低产辣椒连作土壤改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物辣椒CapsicumannuumL.品种为明椒8号，种子购买于福建省三明市农兴种苗有限公司；供试生物炭由水稻秸秆、木质、牛粪和污泥在500℃快速热解产生(过100目筛，分别标记为JGBC、MZBC、NFBC和WNBC)，购买于由广州翠林公司；将制备所得的生物炭分别与高纯水按固液比为1∶30的比例混合，在30℃条件下振荡24 h后，抽滤所得的生物炭浸提液备用[9]。

1.2 生物炭理化性质测定

利用元素分析仪(Vario MICRO, Elementar)测定C、N、H元素质量分数，O的质量分数通过差减法得到；灰分的测定参照标准方法ASTME870-82.4[9]，结果见表1。

表1 不同生物炭灰分含量及元素分析

1.3 生物炭浸提液理化性质测定

生物炭浸提液pH和EC分别用pH计和电导仪进行测定；参考《水和废水监测分析方法》[10]，采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICPMS-2030，岛津，日本)分析浸提液中金属元素含量；分别采用总有机碳分析仪(TOC-V，岛津，日本)和连续流动分析仪(AA3，水尔，德国)测定DOC、DON、NO3--N和NH4+-N含量；采用气相色谱-质谱仪(GC QumMS，赛默飞尔，美国)对生物炭中的PAHs的含量进行分析[11]。结果见表2和表3。

表2 不同生物炭浸提液的部分理化性质分析

表3 不同生物炭浸提液中多环芳烃(PAHs)含量

1.4 试验处理

选取20粒籽粒饱满、大小均一的辣椒种子置于铺有2层纱布的11 cm培养皿中，分别加入10 mL的不同生物炭浸提液，以添加超纯水为对照(CK处理)，每个处理重复6次。培养皿置于28℃的培养箱中培养，光照时间为12 h·d-1，光照强度为3 000 lx；每日补充浸提液或超纯水1.5～3.0 mL(具体量依据种子干湿度确定，且各处理每日添加量保持一致)。以胚根突破种皮1 mm 即视为萌发标准，每天记录发芽种子数量，整个试验共持续20 d。结束后对辣椒幼苗根长、苗高及鲜重、干重、根系活力和部分生理指标进行测定。

1.5 样品分析和指标测定

(1)用直尺分别测量辣椒幼苗的主根长度和胚轴到叶尖端长度，即根长和苗高；将幼苗的地上和地下部分分别在75℃下烘至恒重后称量，即为干重；同时，地下部分干重(g)和地上部分干重(g)的比值为根冠比。

(2)计算种子的发芽势、发芽率和发芽指数[12]。其中，发芽势(GE)为萌发第6 d时发芽种子占比；发芽率(GR)为萌发第14 d时种子萌发比例；同时计算发芽指数(GI)和活力指数(VI)，其中，GI=Σ(Gt/Dt)，Gt为在td的发芽数，Dt为相应的发芽日数；VI=S×GI，S为整株幼苗鲜重(g)。统计萌发时滞、萌发高峰期和萌发持续时间，其中，萌发时滞为试验开始到第1粒种子萌发的间隔期；萌发高峰期为试验开始到当日种子萌发数量最多的间隔期；萌发持续时间为萌发开始至萌发结束的时间间隔。

(3)对幼苗生理指标进行测定，主要包括辣椒幼苗根与叶的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活力以及丙二醛(MDA)含量。用硫代巴比妥酸法测定叶片丙二醛含量[12]；用氮蓝四唑法测定SOD活性，用愈创木酚法测定POD活性，用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定幼苗根系活力[12]。

1.6 数据分析

试验数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析，并利用LSD法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 生物炭浸提液对辣椒种子萌发的影响

由表4可知，MZBC和JGBC处理下辣椒种子发芽势和发芽率较CK处理均无显著性差异；而WNBC和NFBC处理较CK处理种子发芽势分别降低了13.99%、7.80%，发芽率降低了12.62%、11.4%，均呈显著性差异(P<0.05)。

MZBC和JGBC处理下种子发芽指数和活力指数较CK处理均无显著性差异。但WNBC处理下种子发芽指数和活力指数较CK处理分别降低了15.93%和37.84%，NFBC处理下种子活力指数较CK处理降低了42.8%，均呈显著差异(P<0.05)。

与CK处理相比，MZBC处理下辣椒种子萌发时滞缩短了约0.2 d，萌发高峰期提前约0.4 d，萌发持续时间延长了约0.4 d；JGBC处理后，种子萌发时滞缩短了0.34 d，萌发高峰期推迟了0.66 d；而WNBC处理下种子萌发时滞与CK处理无差异，但萌发高峰期推迟了0.66 d，萌发持续时间缩短了0.33 d；而NFBC处理下种子萌发时滞延迟了0.5 d，萌发高峰期推迟了0.33d，但萌发持续时间缩短了0.83 d。

表4 不同生物炭浸提液对辣椒种子萌发的影响

2.2 生物炭浸提液对辣椒幼苗生长的影响

由图1a可知，MZBC处理下辣椒幼苗平均根长和苗高较CK处理分别增加了6.9%和13.29%，但差异不显著；相反的，WNBC和NFBC处理较CK处理辣椒幼苗平均根长分别降低了22.49%、20.24%，株高分别降低了 27.55%、11.78%，差异显著(P<0.05)；而JGBC处理与CK处理间幼苗的平均根长和株高均无显著性差异。

与CK相比，MZBC处理下辣椒的根鲜重和苗鲜重分别增加了18.18%和15.79%(图1b)；NFBC和WNBC处理下辣椒的根鲜重分别下降了36.36%、21.05%(P<0.05)，苗鲜重分别下降了18.18%、32.37%(P<0.05)；而JGBC处理下辣椒幼苗根鲜重较CK处理增加18.18%，苗鲜重较CK处理降低5.26%。

根冠比能反映植物地上部分与地下部分的生长情况。结果表明(图1c)，4个生物炭浸提液处理下辣椒幼苗根冠比均显著低于CK处理(P<0.05)，其中，MZBC处理下的幼苗根冠比较CK处理降低了35.51%，显著低于其余3个生物炭处理；同时，对比根系活力发现(图1d)，JGBC处理下幼苗根系活力显著高于CK处理(P<0.05)，MZBC处理较CK处理提高了9.77%，但差异不显著，而WNBC和NFBC处理较CK处理分别降低了14.29%和18.05%，均达显著差异(P<0.05)。

注：a为幼苗平均根长和株高，b为幼苗平均根、苗鲜重，c为幼苗根冠比，d为幼苗根系活力；不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)图1 生物炭浸提液对幼苗生长的影响Fig.1 Effect of biochar extract solutions on the seedling growth

注：不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)图2 生物炭浸提液对辣椒幼苗根系和叶片丙二醛含量的影响Fig.2 Effect of biochar extract solutions on the content of malondialdehyde in the roots and leaves of pepper seedlings

2.3 生物炭浸提液对辣椒幼苗丙二醛(MDA)含量的影响

由图2可知，NFBC处理下辣椒幼苗根系MDA含量显著高于CK处理(P<0.05)，而其余生物炭处理与CK处理间无显著差异，对比幼苗叶片MDA含量，除JGBC处理显著低于CK处理外，其余3个生物炭处理均与CK处理无显著差异。

2.4 生物炭浸提液对辣椒幼苗抗氧化酶活性的影响

由图3a可知，NFBC和WNBC处理下幼苗根系SOD活性较CK处理分别增加了20.13%和26.99%，而JGBC处理下幼苗叶片SOD活性较CK处理增加了13.35%，均呈显著性差异(P<0.05)。同时，对比根系和叶片的POD活性发现(图3b)，NFBC和WNBC处理下根系POD活性较CK处理分别提高了30.32%和21.41%(P<0.05)，NFBC处理下叶片POD含量较CK提高了13.8%(P<0.05)。如图3c所示，4个生物炭处理中，仅NFBC处理下辣椒根系和叶片CAT活性显著高于CK处理(P<0.05)，分别为51.35%和16.07%。其余处理均与CK处理无显著差异或低于CK处理。

注：(a)SOD活性；(b)POD活性；(c) CAT活性；不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)图3 生物炭浸提液对辣椒幼苗根系和叶片SOD、POD和CAT活性的影响 Fig.3 Effect of biochar extract solutions on the activities of SOD, POD and CAT in the roots and leaves of pepper seedlings

3 讨论与结论

3.1 生物炭浸提液对辣椒种子萌发和幼苗生长差异影响分析

种子萌发和幼苗生长是植物生命周期中关键的时期，对植物的形态建成也至关重要，也是对外界逆境较为敏感的时期之一[13]。本试验结果表明，不同生物炭浸提液对辣椒种子萌发影响差异较大，其中，MZBC处理在促进了辣椒种子的萌发，缩短了萌发时滞，提前萌发高峰期；相反的，WNBC和NFBC处理下辣椒种子萌发率显著降低，萌发时滞和萌发高峰期推迟，对辣椒种子的萌发具有抑制效应。这可能是由于不同原料制备的生物炭所含的物质种类、含量、性质以及正效应因子存在差异所致。

此前，有研究发现，由于生物炭浸提液存在的重金属、PAHs等潜在污染物，对黄瓜、番茄、油菜和小麦种子的萌发均具有抑制效应[7,14-15]。本研究中WNBC和NFBC浸提液中的部分重金属含量显著高于MZBC和JGBC，尤其是Cd含量，高于GB15618-2008《土壤环境质量标准》中二级土壤农用类标准；此前有研究发现[17]，低浓度的重金属胁迫在一定程度上抑制了种子的萌发，因此，基于WNBC和NFBC浸提液处理后辣椒萌发率明显降低，推测这可能主要是由于以上两类生物炭浸提液中重金属含量较高的缘故。同时，本研究中使用的4种生物炭浸提液中PAHs总量均未高于二级土壤农用类标准，且除NFBC显著降低外，其他3个生物炭浸提液之间并无显著性差异。但有研究发现，低分子量的PAHs(<3 环)会对种子的萌发产生强烈的抑制作用[16]。因此，污泥和牛粪生物炭对种子萌发产生抑制的切实原因仍有待进一步研究。前期，李阳等[7]发现，玉米生物炭中存在高含量的PAHs，其浸提液对小麦种子萌发并无明显影响，但对小麦幼苗根、芽生长则呈现低浓度促进而高浓度抑制的 Hormesis效应。这可能是由于小麦种子萌发早期营养源主要为胚内物质，但萌发后期，根、芽生长所需营养主要来源于生长介质的原因。

本研究中WNBC和NFBC处理下辣椒幼苗其根长、苗高和幼苗鲜重与此前种子活力指数所反映的变化趋势基本一致[18]，表明进入幼苗阶段，两种生物炭的抑制效应一定程度仍在持续。同时，生物炭处理下的辣椒幼苗其根冠比均显著低于CK处理，这可能是由于CK组中的生长介质只有水，缺乏必需的营养，因此，幼苗在生长过程中，营养成分优先满足根系生长，较少到达冠部，而生物炭浸提液中含有大量的营养元素[9, 19]可以供幼苗用于根系组织发育和地上部分形态建成，有效降低了根冠比。

3.2 生物炭浸提液对辣椒幼苗抗氧化酶系统影响分析

此前，丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶活性被广泛用作为污染土壤或逆境胁迫下植物损伤的敏感生物标志物[20]。逆境胁迫下，植物通过提高SOD、CAT、POD 活性维持活性氧代谢平衡，以减少脂质过氧化，维持MDA含量在相对较低的水平，确保植物的正常生长[21]。故MDA含量与抗氧化酶活力密切相关[22]。

本研究中NFBC和WNBC处理下幼苗根系SOD、CAT和POD 活性均显著高于CK处理，这可能是胁迫环境下，根系通过开启抗氧化酶系统以减少活性氧的累积。但NFBC处理下的根系MDA含量显著高于其余处理，这可能是NFBC处理下，根系抗氧化酶的调节能力有限，ROS累积导致细胞膜完整性被破坏，加剧了细胞膜脂质过氧化反应，导致根系出现生理损伤[7,15,18]。相较于根系，不同处理下辣椒叶片的抗氧化酶活性变化趋势并不一致，其中，NFBC处理下叶片POD和CAT活性显著高于CK处理，但4个生物炭浸提液处理下叶片MDA含量均未高于CK处理，表明相较于根系，叶中的ROS能被抗氧化酶有效清除，未引起明显的膜脂质过氧化反应。这一结果与李阳等[7]一致，他发现，尽管高剂量生物炭浸提液处理下的小麦幼苗根叶均存在氧化损伤，但由于胚根与处理液直接接触，且敏感性高于胚轴[9]，故根系损伤更为严重。

本研究综合分析了不同来源生物炭浸提液对辣椒种子萌发和幼苗生长的影响，结果表明，污泥生物炭和牛粪生物炭浸提液对辣椒种子萌发呈现出较为明显的抑制效应，且在辣椒幼苗生长过程中均存在氧化应激。这可能与以上生物炭中含过量的重金属有关，但也有文献认为生物炭中的部分多环芳烃是导致其对幼苗早期生长产生明显的毒性效应的诱因[7]。无论如何，在生物炭被广泛应用于农田优化的当下，其对植物的毒理效应及存在的潜在生态环境风险当引起足够重视，生物炭对种子萌发和幼苗生长受生物炭性质和植物特性的多方影响，因此，有必要在大范围推广应用前期，针对性地对生物炭的性质和植物响应进行分析研究，以确保其科学合理使用。