二穗短柄草CYP72A亚族成员表达分析及亚细胞定位

卢盼盼， 张 彪， 孙勤富， 陆盈盈

(扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州 225009)

细胞色素P450(CYP450)广泛存在于动植物和微生物体内，是一类非常重要的氧化酶，可以催化各种复杂的化学反应，在药理学、环境保护及外源损伤修复等方面有较大的应用潜力。CYP450基因家族十分古老，在单子叶植物、双子叶植物分化之前就已经存在。在植物基因组中，CYP450是最大的超家族之一，几乎涉及植物所有的代谢途径，作用底物十分广泛，可以是萜类、苯丙烷类、生物碱、脂肪酸、植物激素、色素、黄酮等次生代谢物。CYP450可以在底物分子中加入氧原子，发生羟基化、环氧化、脱烷基化等化学反应，完成底物的合成或代谢途径，被称为“万能的生物催化剂”。

CYP450可以根据发现的时间顺序分为不同家族。氨基酸序列相似性超过40%的CYP450被归为一个家族，序列相似性超过55%的CYP450被归类为同一个亚族。CYP72基因家族是CYP450中参与次生代谢的最大的酶类族群之一，CYP72A属于CYP72基因家族中的一个亚族，在被子植物中十分保守。

二穗短柄草(L.)植株矮小、生育期短、基因组小，与小麦()等禾谷类作物的亲缘关系较近，且二倍体二穗短柄草(2=10)的基因组与拟南芥()的基因组大小相仿，拥有草类植物种类中最简单的基因组，因此被作为小麦研究的理想模式植物。有研究表明，CYP72A亚族氧化酶参与多种代谢途径。苜蓿()CYP72A67是溶血皂苷生物合成中重要的氧化酶，负责产生主要的皂苷配基——苜蓿酸。苜蓿体内的皂苷含量与、的表达水平密切相关，CYP72A67是皂苷合成中间产物齐墩果酸、常春藤皂苷元C位上的羟化酶，CYP72A68可氧化齐墩果酸、常春藤皂苷元C位。油橄榄()中的2个CYP72成员OeOMES、OeSXS能够在环烯醚萜的生物合成过程中催化氧化状态的C—C化合物裂解。拟南芥CYP72A9是催化赤霉素(GA)C位上的羟化酶，可催化C—H GAs(GA12、GA9和GA4)向C—OH GAs(GA53、GA20和GA1)转化，抑制的表达会导致植物体内GA1含量减少、GA4含量增加。双草醚是乙酰乳酸合酶的抑制剂，水稻()CYP72A31可将双草醚代谢为低毒性的物质，从而增强植株对双草醚除草剂的抗性，植株对除草剂抗性的强弱与CYP72A31表达水平的高低有关。此外，CYP72A亚族基因在抵抗植物病虫害方面也发挥了重要作用。虫害会诱导烟草()基因的迅速表达，过表达CYP72A2的烟草植株增强了对天蛾幼虫、丁香假单胞杆菌的抗性。在抗性品种H7R中，水稻、的表达量在稻瘟病菌侵染后上调，在感性品种H7S中下调，推测这2个基因可能与水稻抗性反应有关。(，)-4，8，12-三甲基-1，3，7，11-十三碳四烯(TMTT)是植物受到植食性昆虫侵害后产生的挥发性化学物质，能吸引害虫天敌从而达到控制害虫的作用。拟南芥的表达量在受到菜青虫侵害时升高，且TMTT含量与转录本水平密切相关。

本研究利用生物信息学、实时荧光定量、蛋白瞬时表达等手段对二穗短柄草CYP72A亚族成员的序列特征、进化关系、组织表达、逆境响应和亚细胞定位等方面进行系统分析，以期为进一步解析CYP72A亚族成员的生物学功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 CYP72A亚族成员的系统进化分析

在Pfam(http：//pfam.xfam.org/)数据库中下载CYP450特征结构域的隐马氏模型文件(Pafm登录号：PF00067)，以PF00067为模型，在植物基因组数据库Phytozome v12.0(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中搜索二穗短柄草中含有CYP450结构域的蛋白序列；用MEGA v10.0.5的MUSCLE计算方法对二穗短柄草、拟南芥CYP72A亚族蛋白序列进行序列比对，并构建系统进化树，分析获得的14个二穗短柄草CYP72A亚族成员。利用MEGA v10.0.5的MUSCLE计算方法对二穗短柄草、拟南芥、水稻、玉米()、大豆()的CYP72A亚族成员进行比对，利用邻接法构建系统进化树，bootstrap值设置为1 000。

1.2 试验材料及胁迫处理

2020年3—7月，将供试材料二穗短柄草Bd21盆栽置于扬州大学温室中培养。用马铃薯培养基在 25 ℃ 恒温箱中培养禾谷镰刀菌(，) 3～5 d，将菌丝挑至绿豆汤培养基中，于25 ℃培养2～3 d。在二穗短柄草开花期，采用单花滴注的方法接种小穗部基部的小花，每个小花接种2 μL菌液(浓度为5×10～10×10孢子/mL)，接种后分别在0、48、96、144 h进行取样；对正常生长的二穗短柄草开花期的小穗、根和叶以及成熟期的种子分别取样，所取样品经液氮速冻后在-80 ℃冰箱中保存。

1.3 二穗短柄草CYP72A亚族基因表达模式分析

用TRIzol试剂盒(Tiangen公司，北京)提取RNA，按照RNA kit cDNA合成试剂盒(TaKaRa公司，大连)合成cDNA第一条链。以二穗短柄草()为内参，利用实时荧光定量PCR仪(BioRad公司，USA)检测CYP72A亚族基因的表达模式，所用引物如表1所示。

1.4 二穗短柄草CYP72A亚族成员的亚细胞定位分析

亚细胞定位分析所用载体为p16318hGFP，p16318hGFP载体包含CaMV35S启动子、绿色荧光蛋白编码序列，利用表1中的引物序列得到扩增产物，将产物连接到p16318hGFP载体上，得到绿色荧光蛋白(GFP)重组质粒。利用聚乙二醇(PEG)介导的瞬时转化方法将GFP重组质粒与内质网maker mRFP-HDEL共转化到小麦原生质体中，室温培养过夜，利用激光共聚焦显微镜检测绿色荧光和红色荧光共表达部位。

表1 本研究所用引物序列

1.5 二穗短柄草CYP72A亚族基因的表达谱数据分析

从GEO数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载二穗短柄草在禾谷镰刀菌处理下的高通量测序数据，登录号为GSE50665。

2 结果与分析

2.1 CYP72A亚族成员的系统进化关系分析

通过序列比对鉴定获得了14个二穗短柄草CYP72A亚族成员。将二穗短柄草CYP72A亚族14个成员的蛋白序列与拟南芥CYP72A的8个成员、水稻CYP72A的13个成员、玉米CYP72A的11个成员、大豆CYP72A的12个成员的蛋白序列进行多重比对，构建系统进化树。结果显示，5个物种的CYP72A成员可以被分成2类，双子叶植物大豆、拟南芥归为Ⅰ类，单子叶植物水稻、玉米和二穗短柄草归为Ⅱ类，推测CYP72A亚族在单双子叶分化之前已经存在，且在单双子叶进化过程中表现出明显差异(图1)。

2.2 二穗短柄草CYP72A亚族基因在不同组织中的表达模式分析

用RT-qPCR分析CYP72A亚族基因在花、根、叶和种子4种组织中的相对表达量，结果显示， 14个CYP72A亚族基因中，有7个基因(、、、、、和)在种子中的相对表达量最高。其中在种子中特异性高表达，在种子中的表达量分别是花、根、叶中表达量的10.3、6.8、7.9倍；、、和在叶中的相对表达量最高(图2)。由此可见，二穗短柄草CYP72A亚族基因的表达具有组织特异性，在种子、叶片中高表达。

2.3 二穗短柄草CYP72A亚族基因在禾谷镰刀菌处理下的表达谱分析

利用GEO数据库中的高通量测序数据，笔者分析了13个二穗短柄草CYP72A亚族基因在禾谷镰刀菌处理下的表达谱。结果显示，除了、、和外，其他基因在禾谷镰刀菌处理下的表达量都上升了2倍以上，其中上调的倍数最高，超过了20倍(图3)，说明二穗短柄草CYP72A亚族部分基因受禾谷镰刀菌诱导表达。

2.4 RT-qPCR分析二穗短柄草CYP72A亚族基因在禾谷镰刀菌处理下的表达模式

为了进一步确定CYP72A亚族基因在禾谷镰刀菌处理下的表达模式，笔者利用RT-qPCR分析了CYP72A亚族基因在不同时间段禾谷镰刀菌处理下的表达模式。结果显示，在禾谷镰刀菌处理下，CYP72A亚族基因相对表达量明显升高的有7个，分别是、、、、、和，其中、、和的上调倍数较高，与0 h的表达量相比，其相对表达量分别在96、144、96、48 h升高了13.8、10.7、8.4、8.1倍(图4)。由此可见，CYP72A亚族基因受禾谷镰刀菌诱导表达，且不同基因对禾谷镰刀菌的响应时间和程度不同。

2.5 CYP72A亚族成员的亚细胞定位分析

笔者将在禾谷镰刀菌处理下上调倍数较高的4个基因(、、和)分别构建到p16318hGFP表达载体上，形成融合表达载体，并将其与内质网maker mRFP-HDEL共转化到小麦原生质体中，分析这4个CYP72A亚族成员的亚细胞定位。结果显示，4个CYP72A亚族成员的GFP荧光与HDEL的红色荧光重叠，表明4个CYP72A亚族成员(Bradi2g41110、Bradi2g44160、Bradi2g44190和Bradi2g44200)都定位于内质网(图5)。

3 讨论与结论

CYP72A亚族基因常成簇存在于染色体上，如水稻的9个CYP72A亚族基因成簇排列于1号染色体上，拟南芥的9个CYP72A亚族基因成簇排列于3号染色体上，玉米的9个CYP72A亚族基因分2簇排列于1号染色体上，番茄的11个CYP72A亚族基因成簇排列于7号染色体上，二穗短柄草的14个CYP72A亚族基因中仅有定位于1号染色体上，其他13个基因都定位于2号染色体上，其中、、、、、和成簇排列于2号染色体上，且、、、和受禾谷镰刀菌诱导上调表达，说明二穗短柄草CYP72A亚族基因簇具有一定的共表达特性。与、的氨基酸序列相似性分别达到了82.83%、81.29%，推测这3个蛋白对应的基因可能由基因复制产生，在进化过程中逐渐分化，并可能协同发挥功能。

Prall等分析了33种植物(包括8种单子叶植物和25种双子叶植物)的CYP72A亚族成员的系统进化关系，结果显示，8种单子叶植物中所有CYP72A亚族成员聚为一类，除荷花外的24种双子叶植物的所有CYP72A亚族成员聚为1个大的分支，荷花的1个CYP72A亚族成员单独为1个分支。单子叶植物二穗短柄草、水稻、玉米的CYP72A亚族成员与双子叶植物拟南芥、大豆CYP72A亚族成员在进化上形成2个明显不同的进化分支。这些结果表明，植物CYP72A亚族在单、双子叶分化之前已经形成，且在单、双子叶进化过程中形成了不同的进化方向。

在正常生长条件下，水稻在根中表达，在地上部分不表达，而在多种除草剂诱导下，在根中的表达量会减少，在地上部分的表达量会增加。也有研究结果表明，在水稻抽穗期，、在水稻叶片中的表达水平最高。分析不同植物CYP72A的组织表达模式可见，不同成员间的表达模式有一定的相似性，如拟南芥CYP72A9在长角果中的表达量最高，其次是在叶片、根和种子中，在花、茎中的表达量较低。二穗短柄草、、、、、和的表达量也是在种子中最高，其中在种子中特异性高表达，推测二穗短柄草CYP72A亚族可能在种子生长及代谢途径中发挥重要功能。

水稻、、受病原菌侵染诱导表达。顺式茉莉酮是植物受到昆虫侵害后释放出的物质，拟南芥、在顺式茉莉酮诱导下强烈上调表达。烟草在受昆虫侵害后迅速诱导表达，在烟草中过表达能够增强对天蛾幼虫、丁香假单胞杆菌的抗性。欧洲山芥的CYP72A552能够催化皂苷的形成，激活植物对小菜蛾、烟草天蛾害虫的防御功能。RT-qPCR结果显示，二穗短柄草CYP72A亚族中7个基因的相对表达量在禾谷镰刀菌处理下明显升高，推测植物CYP72A亚族基因不仅参与氧化代谢途径，可能还参与禾谷镰刀菌的防卫反应。

拟南芥CYP72A9是定位于内质网的GA13-羟化酶，可催化GA4、GA9和GA12转化为GA1、GA20和GA53，从而影响种子休眠过程。也定位于内质网，功能缺失会导致节间变短、株高降低、生育期延长。亚细胞定位分析结果显示，4个CYP72A亚族成员(、、和)都定位于内质网，且受禾谷镰刀菌诱导表达，上调倍数均超过8倍，推测这4个CYP72A亚族成员可能通过内膜系统参与代谢过程及生物胁迫响应。