原发性胆汁性胆管炎患者外周血Treg/Th17细胞相关细胞因子水平变化*

骆苏彦，李婷婷，王亚奇，齐 林

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是具有进行性、破化性和非化脓性等病理学特点的慢性自身免疫性肝内胆汁淤积性疾病，多发于中老年女性，临床以乏力和皮肤瘙痒等为主要表现[1，2]。PBC患者病情进展，可发展为纤维化和肝硬化，对肝脏的生理功能造成严重的不良影响。准确诊断PBC患者肝纤维化、及时评估肝纤维化程度对控制病情进展、改善患者预后具有重要的价值。现阶段，临床诊断肝纤维化的金标准为肝穿刺活检，而肝穿刺活检具有取样体积小、有创、可能出现判断误差和重复性差等缺点[3]。因此，探寻重复性好、操作便捷简单的诊断方法已成为临床研究的重点。既往研究显示，调节性T淋巴细胞(regulatory T cells，Treg)/辅助性T淋巴细胞17(T helper cells 17，Th17)在机体内处于平衡状态。当两者失衡时，可引起免疫系统功能异常[4]。临床研究发现，Treg/Th17细胞平衡被打破后会促使肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，释放细胞外基质，分泌促纤维化细胞因子，造成胶原沉积，导致肝组织发生纤维化转变[5，6]。本研究检测了PBC患者外周血Treg/Th17细胞相关细胞因子的变化，旨在为临床评估PBC患者肝纤维化程度提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例来源 2019年1月～2021年12月我院收治的PBC患者59例，男性13例，女性46例；年龄为36～68岁，平均年龄为(54.26±6.89)岁。符合《原发性胆汁性肝硬化(又名原发性胆汁性胆管炎)诊断和治疗共识(2015年)》[7]的诊断标准。排除标准：①合并酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、药物性肝损伤等其他肝病者；②合并肝脏或肝外恶性肿瘤者；③妊娠或哺乳期妇女；④存在传染性疾病者；⑤合并精神疾病或认知功能严重障碍者。另选择同期在我院健康体检的59名志愿者作为健康对照，男性21例，女性38例；年龄为32～65岁，平均年龄为(53.75±6.06)岁。两组性别和年龄比较无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。本研究经我院医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 外周血Treg/Th17细胞和相关细胞因子检测 使用美国Beckman公司生产的FC500流式细胞仪检测外周血Treg细胞和Th17细胞百分比(Biolegend公司的Th17流式检测试剂盒和Treg一步法流式检测试剂盒)；采用ELISA法检测血清白细胞介素(interleukin，IL)-10、IL-6和IL-17水平。

1.3 肝穿刺活检 患者取仰卧位，行局部麻醉，常规消毒。在超声引导下使用穿刺枪和一次性16G针穿刺肝组织，得到肝组织数条，经福尔马林固定，石蜡包埋，常规HE、Masson和网状纤维染色。采用Metavir评分系统评估肝纤维化程度：无纤维化为F0期；门脉区纤维化，无纤维间隔形成，为F1期；门脉区纤维化增大，形成少数纤维隔，为F2期；大部分纤维隔形成，无硬化结节，为F3期；早期肝硬化为F4期，其中肝纤维化F0期和F1期为非显著性肝纤维化，F2期、F3期和F4期为显著性肝纤维化。

2 结果

2.1 两组外周血Treg/Th17细胞百分比比较 PBC患者外周血Treg细胞比率、Th17细胞比率和Th17/Treg比值显著高于健康人(P<0.05，表1)。

表1 两组外周血Treg/Th17细胞百分比比较

2.2 两组血清细胞因子水平比较 PBC患者血清IL-10、IL-6和IL-17水平显著高于健康人(P<0.05，表2)。

表2 两组血清细胞因子水平比较

2.3 不同肝纤维化程度的PBC患者外周血Treg/Th17细胞百分比比较 经肝组织病理学检查显示，在59例PBC患者中诊断肝纤维化F0期3例，F1期17例；F2期19例，F3期16例，F4期4例，即非显著性肝纤维化组20例和显著性肝纤维化组39例；显著性肝纤维化组外周血Treg细胞比率、Th17细胞比率和Th17/Treg细胞比值显著高于非显著性肝纤维化组(P<0.05，表3)。

表3 不同肝纤维化程度的PBC患者外周血Treg/Th17细胞百分比比较

2.4 不同肝纤维化程度的PBC患者血清细胞因子水平比较 显著性肝纤维化组血清IL-10、IL-6和IL-17水平显著高于非显著性肝纤维化组(P<0.05，表4)。

表4 不同肝纤维化程度的PBC患者血清细胞因子水平比较

2.5 外周血Treg/Th17相关细胞因子评估PBC患者显著性肝纤维化的价值 经ROC曲线分析结果显示，外周血Treg细胞比率、Th17细胞比率、Treg/Th17比值、血清IL-10、IL-6和IL-17水平联合评估PBC患者显著性肝纤维化具有较高的诊断效能(P<0.05，表5，图1)。

表5 外周血Treg/Th17相关细胞因子对PBC相关肝纤维化程度的诊断价值

图1 外周血Treg/Th17相关细胞因子诊断PBC患者显著性肝纤维化的ROC曲线

3 讨论

现阶段，PBC的病因和发病机制仍处于研究中。多数学者认为是环境和遗传因素相互作用引起免疫功能紊乱导致的疾病发生[8]。评估慢性肝病患者肝纤维化程度是临床控制病情的重要部分[9]。由于肝纤维化早期的可逆性和后期的不可逆性，临床对于不同程度肝纤维化患者的治疗方案存在差异[10]。因此，在早期及时诊断肝纤维化并给予针对性的治疗对延缓或避免不可逆转肝硬化具有重要的意义。肝组织病理学检查是诊断肝纤维化的重要手段，但存在较多不足，不利于诊疗工作的进行[11]。临床研究发现，肝纤维化患者接受常规肝穿刺活检的检查率低于20%[12]。因此，寻找便捷、安全和有效的评估指标对明确肝纤维化程度、指导后续治疗尤为重要。

Treg细胞具有负相调控功能，可抑制过激的免疫反应，维持机体免疫功能的平衡。既往研究发现，在病理状态下Treg细胞能特异性表达FoxP3，影响TGF-β和IL-10分泌，从而抑制炎症刺激反应，激活免疫抑制功能，调控免疫反应，阻止过激的免疫应答[13，14]。IL-10作为Treg细胞产生的相关细胞因子，能抑制Th1细胞增殖，影响免疫应答，抑制机体炎症反应[15]。有报道显示，Treg细胞和IL-10与肝纤维化进程有关，重度肝纤维化患者外周血Treg数量和IL-10水平明显增加[16]。Th17细胞是独立的Th细胞亚群，能通过表达IL-17和IL-6等多种炎性细胞因子，介导机体炎性反应过程。在病理状态下，Th17细胞能持续性表达细胞因子，引起病理性炎性反应，而机体在炎症反应刺激下会释放大量TGF-β，与IL-6发挥协同效应，促进Th17细胞活化，最终加重炎性损伤[17，18]。Treg/Th17细胞失调是肝病患者发生肝纤维化的重要因素。肝纤维化患者外周血存在明显的Treg/Th17细胞失调。本研究结果显示，显著性肝纤维化患者外周血Treg细胞比率、Th17细胞比率和Th17/Treg细胞比值、血清IL-10、IL-6和IL-17水平显著高于非显著性肝纤维化患者，提示Treg/Th17细胞及其相关细胞因子与PBC患者肝纤维化程度存在联系。在肝纤维化进展过程中，肝星状细胞的激活发挥着重要作用。在正常状态下，肝星状细胞处于静止模式。罹患PBC导致肝细胞损伤，在病理因素作用下，肝星状细胞被激活和增殖，同时释放大量的细胞外基质，引起肝内过多的胶原蛋白沉降，从而改变肝小叶结构，诱发肝纤维化，逐渐发展为肝硬化[19]。Treg细胞可以分泌TGF-β，通过Smad信号蛋白通路介导和促进肝星状细胞释放细胞外基质，促进肝纤维化进程。Th17细胞释放的IL-17能与表达IL-17受体的肝星状细胞结合，从而激活肝星状细胞，通过释放IL-23等细胞因子提高TGF-β表达。在TGF-β作用下肝星状细胞合成细胞外基质的速度加快，引起肝纤维化。此外，IL-17大量增加还会诱导IL-6分泌，激活STST3信号通路，促进肝纤维化进展[20]。本研究经ROC曲线分析显示，外周血Treg/Th17细胞及其相关细胞因子联合诊断PBC患者显著性肝纤维化程度的AUC高达0.956，高于单一指标诊断，提示联合诊断的效能更高。