环介导等温扩增法与重组酶聚合酶扩增法用于孕妇B族链球菌定植筛查的价值

马小波，梁朝霞，吴 勇，何玉萍，刘鸿飞，董 艳

1.江苏省南京市高淳中医院检验科，江苏南京 211300；2.徐州医科大学附属沭阳医院检验科，江苏沭阳 223600；3.徐州医科大学附属沭阳医院妇产科，江苏沭阳 223600

B族链球菌(GBS)定植是发生早发型新生儿败血症的主要原因[1]。GBS定植具有起病隐匿、症状不典型的特点[2]。多方共识指出：孕35～37周进行直肠及阴道GBS定植筛查有助于减少产妇分娩风险及新生儿感染风险[3-5]。GBS定植的筛查临床上多以培养法作为判断GBS定植的金标准，但培养法多需要48 h以上，其耗时长、灵敏度差[6]。聚合酶链反应(PCR)或荧光PCR虽然能够减少鉴定时间，已经逐渐取代培养法成为新型筛查方式，但其对仪器及设备的成本需求相对较高，不适合中小型医院应用[7]。环介导等温扩增法(LAMP)的反应时间仅需几十分钟，反应结束可通过肉眼直接观察，简单、高效[8]。重组酶聚合酶扩增法(RPA)能在15 min内进行DNA扩增，但缺乏有效的直接观察方式[9]。两种方法均属于恒温环境下来进行DNA扩增的有效方式，简单、方便。为进一步明确LAMP及RPA用于孕妇GBS定植筛查的价值故进行本研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年5月至2019年7月在徐州医科大学附属沭阳医院(以下简称该院)采集的68例孕35～37周孕妇阴道及直肠拭子作为主要检测标本。纳入的孕妇在4周内未进行抗菌药物治疗。取孕妇肛周分泌物及阴道下三分之一处分泌物等分为3份，标记后进行孕妇GBS定植筛查。

1.2仪器与试剂 PCR仪(含染料，上海星汉生物科技有限公司，型号：2×Taq MasterMix)、高速离心机(常州市亿能试验仪器厂，型号：TG16G)、电泳仪(南京普阳科学仪器研究所，型号：LG4C0818)、凝胶成像仪(赛默飞世尔科技公司，型号：E-Gel Imager凝胶成像仪-紧凑型凝胶成像系统)、恒温水浴锅(苏州珀西瓦尔试验设备有限公司，型号：TZL-5002)、核酸染料(上海抚生实业有限公司，型号：SYBR GreenⅡ)。LAMP试剂盒(苏州天隆生物科技有限公司，国械注准20193400369)、RPA反应试剂盒(广州市宝创生物技术有限公司，国械注准20213400530)、TwistAmp®LF免疫金试纸条(广州市微米生物科技有限公司,国械注准20193400250)。

GBS标准菌株选择购自上海素尔生物科技有限公司的无乳链球菌ATCC13813菌株作为阳性菌株；将该院培养的化脓性链球菌、肺炎链球菌、星座链球菌、金黄色葡萄球菌、F组链球菌各1株作为阴性菌株。

1.3方法

1.3.1标本的处理 将采集的孕妇阴道及直肠拭子置于1 mL无菌蒸馏水中，10 000 r/min高速振荡60 s，10 000×g离心300 s，弃去上清液；再加入0.1 mL无菌蒸馏水中沉淀后，再次离心，弃上清液；再加入0.1 mL无菌蒸馏水重悬沉淀后依据沸水浴法提取DNA，一份行LAMP检测，一份行RPA检测，另一份行16s rRNA测序，应用GenBank数据比对确定细菌DNA。

1.3.2DNA提取方法 应用移菌环自血平板上刮取培养完成的菌株，置入0.1 mL的无菌蒸馏水中，在沸水中水浴10 min，10 000×g离心2 min(分离线粒体)，取上清液备用，作为模板DNA(ATCC13813菌株为阳性模板，其他菌株为阴性模板)。

1.3.3LAMP 将LAMP试剂盒中的反应液、显色液FDR和2 μL的模板DNA置入0.5 μL的PCR管中，混合均匀，再置入63 ℃的恒温水浴锅中反应0.5～1.0 h后取出，置入判定结果。

1.3.4RPA 严格按照RPA试剂盒说明书进行操作，RPA反应体系(47.5 μL)：10 μmol/L的上下游引物各2.4 μL，DNA模板2 μL、重组缓冲液29.5 μL，超纯水11.2 μL制成混合液。将混合液移入预装好冻干粉的反应管中，混合均匀后加入2.5 μL MgAc，使最终反应体积达到25 μL，置入PCR扩增仪，运行20 min。运行4 min时，取出PCR管，轻弹并混匀，再放回38 ℃的恒温仪中继续孵育。运行结束后将扩增产物取出12.5 μL置入新的EP管中，后续经DNA纯化及琼脂糖凝胶电泳，并将余下的孵育产物进行TwistAmp®LF免疫金试纸条检测。

1.3.5判定方法 LAMP结果判定：以反应液变为绿色作为阳性结果，反应液无变色为阴性结果。RPA结果判定：以出现反应条带为阳性结果，无反应条带为阴性结果。本研究以ATCC13813菌株检验结果为阳性对照组，其他标本为阴性对照组，并以16s rRNA测序结果为金标准。

1.3.6评估方法

1.3.6.1灵敏度评估 取无菌双蒸馏水对待测模板DNA做10倍梯度递减稀释，并以模板DNA检验情况最低浓度判断。同时对比不同检测方法的阳性结果准确率。

1.3.6.2特异性评估 以阴性菌株为模板，应用LAMP、RPA检测，并进行评估，以确定LAMP、RPA对GBS的诊断特异性。

1.3.6.3时效性评估 采集自开始检验至检验结果产生的时间差进行比较，确定两种检验方法的时效性差异。

1.3.7观察指标 观察LAMP及PRA的最佳引物、反应条件、反应时间及检测的灵敏度、特异性。

2 结 果

2.1LAMP和RPA的最佳引物和反应条件对比 本实验自5组LAMP引物中选择一组反应迅速、特异性高的引物作为最佳引物，该引物最佳反应条件：63 ℃，反应45～60 min。反应45 min时，LAMP检测管颜色自橙色逐渐转为绿色标本为阳性，延长时间至60 min无颜色变化，阴性标本为橙色。RPA的引物以F3、B3为主，其最佳反应温度为38 ℃，恒温15 min。见表1。

表1 最佳引物序列

2.2两种方法的灵敏度及特异性对比 经LAMP及RPA检测，45 min时，ATCC13813菌株DNA模板水平在0.01～10.00 ng/μL时，两种检测方法均能够有效筛查阳性标本，检验极限均为0.01 ng/μL。经LAMP及RPA检测确定，而对于阴性菌株可以明确排除。两者的特异性一致。见表2。

表2 LAMP及RPA特异性比较

2.3两种方法的时效性及准确性对比 68例标本中共6例阳性、62例阴性，GBS定植率为8.82%。LAMP共耗时69 min，LAMP测定仅需要恒温仪即可判读；RPA测定68例标本，共耗时130 min，需要使用恒温仪、电泳仪和凝胶成像仪或免疫金试纸条才能产生准确结果。两种检测方法临床准确性比较，LAMP共检出6例阳性、62例阴性，与16s rRNA测序结果完全一致；而RPA电泳法共检出7例阳性(假阳性1例)，61例阴性；RPA免疫金试纸条检测与LAMP测定结果一致，仅需20～30 min即可完成。

3 讨 论

GBS定植筛查已经成为发达国家对孕35～37周筛查的主要指标之一。研究显示，孕晚期妇女GBS定植率为15.58%，以30～40岁孕产妇多见[10]。这一结果与本研究纳入标本的GBS定植率8.82%(6/68)大致相当[11]。我国民众对GBS的了解少，故GBS定植筛查的普及率相对较低；而且受到筛查时间、筛查技术难度及费用昂贵的限制，多数孕期妇女对GBS认识不足，难以建立有效的GBS定植筛查机制[12]。随着GBS DNA诊断技术的发展，PCR技术逐渐成熟，但是在中小型医院由于经费等原因仍难以普及[13]。

LAMP及RPA能够减少早期筛查成本，降低筛查时间损耗，灵敏度高、特异性好，与PCR技术相比，经济价值及诊断效能更佳。与传统PCR技术相比，LAMP及RPA更加快速、方便，且对设备需求度低[14]。LAMP采用6个不同区域靶基因制订4条特殊引物，经过起始及循环扩增形成最终的花椰菜样茎-环状结构DNA混合物[15]。在LAMP反应过程中，焦磷酸镁沉淀作为主要副产物存在，使得肉眼能够有效分辨荧光染料，具有可视性，但LAMP的引物设计较为复杂，在一定程度上限制了其临床应用程度[16]。

RPA与LAMP相比，反应温度更接近人体体温，在37～42 ℃进行，单链核酸重组酶UvsX与引物相结合，利用Bsu DNA聚合酶实现链置换，在这个置换过程中，引入单链DNA结合蛋白Gp32核酸蛋白形成复合体，在多种因子共同作用下，基因链的延伸与配对过程才能实现[17]。但由于反应情况无法进行视觉诊断，多应用凝胶电泳成像技术进行定性检测，但低浓度模板可能出现非特定信号污染，其诊断时效性及准确性较低[18]。但结合免疫金试纸条技术能够减少低浓度模板的信号污染，避免假阳性标本产生，且基因扩增完成后即可进行检测，显像仅需5 min，有效地弥补了RPA在GBS定植筛查过程中的缺陷[19]。

本研究结果发现，LAMP的基因扩增对设备需求更低，适合基层医院应用；而RPA扩增后应用免疫金试纸条进行定性检测，耗时更短，且结果与LAMP一致，虽然增加一定的检验成本，但节约检测时间，适合中型以上医院选用[20]。LAMP和RPA(免疫金试纸条判读)的灵敏度及特异性一致。

综上所述，LAMP及RPA对设备依赖程度较低，RPA基因扩增速度快，LAMP总耗时相对较短，且具有可视性，RPA扩增后采用免疫金试纸条方式诊断灵敏度及特异性与LAMP一致，两种方法均具有简单、高效的特点，适用于孕妇GBS定植筛查。