基于网络药理学与分子对接研究黄芪-附子治疗慢性心力衰竭的机制

李钰鑫 阎美卉 李 森

(北京中医药大学生命科学学院，北京，102488)

慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure，CHF)，又称为慢性充血性心力衰竭，是一种临床综合征，表现为各种原因导致心脏功能及结构发生变化，引起舒张功能障碍，血液不能正常充盈心脏，或指心脏无法将血液充分地泵出，使心排血量减少，进而引起肺/体循环淤血、各组织灌注不足，甚至引发器官灌注受损。据统计，心力衰竭现已成为现代社会一个重要的公共卫生问题，其发病率、死亡率高，预后差。据统计，在发达国家55岁人群中，约有三分之一的人将发展为心力衰竭，且其诊断后5年生存率仅有35%[1]。2018年中国心血管病报告指出，我国心血管疾病死亡率占居民死亡率的40%，心力衰竭患病率约有1.3%，而心力衰竭的发病率与年龄正相关，中国老龄化问题日趋严重，心力衰竭发病率及死亡率处于上升阶段，因此防治心力衰竭已成为重要民生问题[2]。心力衰竭最早出现于《金匮要略》，张仲景首次提出“心水”病，并记载：“其身重而少气，不得卧，烦而燥，其人阴肿。”现代医学认为心力衰竭大致属于中医基础理论的“心水”“惊悸”“怔忡”“喘证”“水肿”等范畴[3-4]。

欧洲心脏病学会(European Society of Cardiology)指出，常用于治疗心力衰竭的药物大致有血管紧张素转换酶抑制剂、抗醛固酮剂、利尿剂、β受体阻滞药、强心苷类等，尽管这些药物能够在短期内提供较好疗效，但某些药物长期使用会产生很多不良反应，如长期使用利尿剂可能导致低血钾症、心律失常等，血管紧张素转换酶抑制剂可能会引发中性粒细胞减少、肾功能损伤等[5-8]。中医治疗心力衰竭的历史悠久，疗效突出，不良反应小，中医认为心力衰竭病机为本虚标实，病位在心，并与肺、肝、脾、肾相关[9-10]。心力衰竭可分为气虚血瘀、阴虚血瘀、阳虚血瘀等基本证型[11]。在临床中，心肾阳虚证患者所占比例最大，对该类患者运用益气温阳、利水消肿法则具有很好疗效[12]。黄芪、附子均为益气温阳药，黄芪可补气健脾，升举阳气，固表，利水，消肿，可补益后天之阳；附子回阳救急，温肾助阳，散寒止痛，可温壮元阳，大扶先天之阳，二者配伍，可互相为用，增效减毒，临床上此药对常用于治疗心力衰竭。含有黄芪-附子药对的如芪附汤，常用来治疗心力衰竭，芪苈强心胶囊，以黄芪附子为君药，可增强心肌收缩以及改善心脏功能，疗效显著[13-15]；另外还有参附芪养心汤、麻黄附子黄芪汤、加味麻黄附子细辛汤、桂附养心汤、强心方均应用这一药对，临床研究发现这些方剂对心律失常、心力衰竭均都有很好疗效[16-20]。黄芪-附子药对使用广泛，但因其有效成分众多，靶点复杂，涉及的分子机制尚不明确。网络药理学是通过构建“中药-成分-靶点-通路-疾病”的网络，揭示小分子调控的原理，其优点在于系统、全面分析多靶点药物对各类疾病的作用。本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)、PubChem等数据库筛选此药对的有效成分，并统计其成分的作用靶点，通过人类基因数据库(GeneCards)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)等数据筛选并收集心力衰竭相关靶点，导入String数据库并初步构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络，利用PubChem、RSCB PBD等数据库收集蛋白信息，并在AutoDock Vina进行分子对接。最后利用David等进行生物富集分析，将所有结果导入Cytoscape进行网络构建，并根据结果进行后续分析讨论，为黄芪-附子药对提供分子机制支持。

1 资料与方法

1.1 “黄芪-附子”药对活性成分与作用靶点的筛选与收集 TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)是基于中药系统药理学数据库的框架建立的一个综合研究中药的分析平台，包括499种中药材，含有29 384个化学成分，3 311个靶点[21]。UniProt(http://www.uniprot.org/)是一个公开、免费的蛋白质序列和功能信息资源数据库。利用TCMSP分别检索“黄芪”“附子”，选择利用类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18和口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%来筛选该药对的活性成分，将符合条件的活性成分及其对应靶点导出，通过UniProt数据库转换为Gene Name，其检索条件设置为Human-Reviewed，将每个靶点名规范为基因名并导入Excel[22]。

1.2 CHF靶标的获取与收集 GeneCards(https://www.genecards.org/)是一个综合数据库，建立了基因与疾病之间的联系，并集成了来自150个网站来源的基因数据[23]。OMIM( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)是一个是基于基因和遗传表型以及它们之间的关系的综合数据库[24]。以“chronic heart failure”“cardiac failure”“heart failure”“myocardial failure”“congestive heart failure”为关键词检索GeneCards与OMIM，在OMIM的gene map检索处输入关键词，将数据一同导出，2次数据去重合并[25]。

1.3 药物与疾病靶点的筛选与PPI网络的构建 String数据库(https://string-db.org/)提供了评估与整合直接(物理)和间接(功能)作用的PPI网络的数据库[26]。Cytoscape 3.8.0(https://cytoscape.org/)是一个开源软件，可用于集成任何可视化复杂网络[27]。将药物靶点与疾病靶点合并并去重，取二者的交集，输入String数据库，物种选择“Homo sapiens”，最低互作分数选择0.9(Highest Confidence)，将数据输出为tsv格式。将靶点文件及说明文件导入Cytoscape 3.8.0，选择Analyze Network，并根据分析结果中的度(Degree)值，调节节点大小。Degree值指的是连接到网络中其他节点的节点数，Degree越大，节点越关键。

1.4 基因本体(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) David数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)是在线基因注释富集分析工具。为分析重合靶点中的基因功能，进行GO富集分析及KEGG通路富集分析，将上述结果输入Fictional Annotation，将列表与背景均设置为“智人”，筛选条件为P<0.01[28]。将前30位结果导出，并根据现有文献研究，筛选心力衰竭相关通路，并将通路与上述结果合并到Cytoscape。

1.5 分子对接(Molecular Docking)反向验证 AutoDock Vina(http://vina.scripps.edu/)是基于AutoDock 4的一个更优更高效的分子对接程序，用于预测大分子受体与小分子配体的结合构象和结合亲和力[29]。PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)是一个免费获取化学信息的网站，包括化学成分名称，分子式，结构等。RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)包含实验已确定的蛋白质、核酸等的结构的信息。分子对接通过“锁钥原理”预测药物小分子与蛋白受体相互作用，并计算模拟配体与受体之间的对接模式和对接分数。通过分子对接的虚拟筛选，对上述结果进行二次验证。将PPI网络中Degree导出，筛选前5位靶标，将其基因名转化为PDB ID，在RCSB PDB中下载相应3D结构，并利用AutoDock Vina软件，将这5个关键靶点结构与黄芪-附子要对的活性成分结构进行分子对接，其Affinity(kcal/mol)(1 cal=4.184 J)值即代表二者结合的亲和力[30]。

2 结果

2.1 黄芪-附子化合物及其靶标 符合OB≥30%、DL≥0.18筛选条件的共有41个化学成分，其中黄芪20个，附子21个。黄芪包括异鼠李素、山柰酚、槲皮素、刺芒柄花素等；附子包括德尔妥因、干华豆晶等。见表1。共获得211个靶点。

表1 黄芪-附子主要化学成分及简称

2.2 CHF靶标筛选 在GeneCards与OMIM分别找到12 598与641个相关靶点，汇总去重，共有13 051疾病靶点，将药物靶点与心力衰竭靶点进行合并，二者交集共207靶点，最终得到183节点与808条交互关系。其Degree值前5位的分别为AKT1、MAPK1、JUN、TP53、TNF。见图1。

图1 基于String的黄芪-附子对心力衰竭的PPI网络

2.3 分子对接二次验证 部分分子对接结果效果见图2。共有174个对接结果Affinity≤-6.25 kcal/mol。见图3～4。

图2 分子对接显示靶标与其结合能前5位药物分子的结合情况

2.4 GO富集分析、KEGG富集分析与PPI构建 对与心力衰竭关联的黄芪-附子的183靶点进行GO富集分析与KEGG富集分析，发现共有887条GO功能与134条KEGG信号通路。见图5～6。GO富集分析包括转录调控、信号转导、凋亡调控、细胞增殖、炎症反应、对药物的反应等生物学过程；涉及细胞核、细胞质、质膜、线粒体等细胞组分；并与蛋白质结合、酶结合、ATP结合等分子功能相关。而黄芪-附子对心力衰竭涉及的KEGG信号通路主要包括HIF-1信号通路、MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、Toll-like Receptor信号通路等，将KEGG通路相关靶点汇总于上述Cytoscape 3.8.0，并完成PPI网络构建。见图7。

图3 前5位靶标与药物成分进行分子对接得到的各自最低结合能热图

图4 分子对接验证数据统计

图5 黄芪-附子-心力衰竭靶标的GO富集分析

图6 黄芪-附子-心力衰竭靶标的KEGG通路富集分析

图7 中药-成分-靶点-通路-疾病网络构建

3 讨论

分子对接二次验证发现，其Affinity(kcal/mol)为负数的数值越低，代表结合活性越强[31]，从该结果可看出，AKT1、MAPK1、JUN、TP53、TNF这5位靶标与黄芪-附子中活性成分结合力较强，因此验证了前期研究的可信性。

本研究采用网络药理学的方法，对黄芪-附子这一药对的活性成分进行了筛选。黄芪发挥治疗心力衰竭药效可能的化学成分为山柰酚、芒柄花素、槲皮素、异鼠李素等，它们都属于黄酮类化合物；而附子发挥药效的可能化学成分为石防风素和水黄皮素。

研究表明，山柰酚(Kaempferol)可以抑制核因子κB与MAPKs信号通路激活，缓解心肌炎症反应，通过调节AMPK/Nrf2信号通路对由AngⅡ诱导的氧化应激反应进行抑制，从而减缓胶原蛋白沉积，预防心脏纤维化，改善心脏重构，应用于心力衰竭治疗[32-33]。芒柄花黄素(Formononetin)被证实可以有效改善缺氧/复氧诱导下H9C2心肌细胞的细胞状态与成活率，降低ROS水平，提高血管内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶的表达水平，减少功能异常，进而对心血管系统提供保护[33-34]。槲皮素(Quercetin)被证实能够通过上调蛋白激酶Cε的表达水平抵抗心肌细胞缺氧复氧损伤，使乙酰胆碱增强心房利尿钠肽分泌的功能得到提升，同时提高心肌组织中利尿钠肽受体-A和内皮型一氧化氮合酶的表达效应，令ANP/NO信号通路得到激活，由此改善心律失常、降低心脏负担、有效防治心力衰竭[35-36]。异鼠李素(Isorhamnetin)可清除羟基自由基，显著抗油脂氧化，通过多条通路发挥降压、缓解心肌肥厚、抗血栓形成等功能，实现心血管系统的总体保护，预防心力衰竭[37]。水黄皮素(Karanjin)，又称干华豆晶4，通过抑制I-κB降解来降低活性氧水平并限制核因子κB的表达，发挥抗氧化作用为心肌细胞提供保护[38]。石防风素(Deltoin)，又称德尔妥因，有抗心律失常的功能，同时作为一种香豆素类化合物可以抑制钙离子进入细胞，发挥降压及松弛血管，促进凝血酶原发挥抗凝作用，进而保护各种诱因引起的CHF[39]。其他化合物和靶标也具有更深一步研究探索的潜力。

通过KEGG富集分析发现，黄芪-附子药对治疗心力衰竭的主要信号通路包括HIF-1信号通路、MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、Toll样受体信号通路。研究表明，HIF信号通路，参与机体适应低氧或缺氧环境，可促进血管生成，参与心肌细胞葡萄糖的摄入和转运，增强线粒体氧化磷酸化，激活血管张力调节和红细胞生成有关的基因，其通过降低氧气消耗、上调厌氧过程、调节氧稳态来响应缺氧环境，进而减少心肌梗死并抑制急性心肌梗死中心脏功能障碍的发展[40-43]。MAPK信号通路包括MAPK/ERK家族、BMK-1、JNK、p38信号家族，该通路参与细胞增殖、分化与凋亡、炎症和先天免疫等，其中p38通路参与介导负性肌力，并可能促使心肌肥大的发生[44-47]。p38通路的激活会诱使心肌收缩力降低，舒张功能受损，肥大基因表达与心力衰竭特定重塑[46]。PI3K-AKT信号通路则参与调节心脏生长、血管生成和心肌细胞死亡，通过影响心肌钙循环进而改善心肌收缩功能，通过抑制心肌细胞凋亡进而减轻心力衰竭[48-49]。TNF信号通路与心肌肥大、左心室重塑、内皮功能障碍相关，且其肿瘤坏死因子-α降低了一氧化氮生物利用度，增加了细胞内活性氧[50-51]。心力衰竭是由许多损害心肌的情况引起的，有证据表明，炎症与心力衰竭有密切关系，Toll样受体信号通路，在心力衰竭期间参与炎症反应，并促进心力衰竭的发展[52]。

综上所述，本研究探索了黄芪-附子药对的分子机制，发现该药对可通过多靶点对心力衰竭起到治疗作用，为临床研究提供一定的参考，但其具体通路及靶标有待进一步研究。