基于网络药理学研究陇产当归挥发油类成分多维药理的作用机制

刘方舟 杨 阳 李 萌 杜 昱 张一颖 李逸豪 王 静 李园白

(中国中医科学院中医药信息研究所，北京，100700)

当归来源于伞形科当归属植物Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根[1]，又名干归、马尾归、秦哪、秦归、云归、马尾当归、岷归等，是中医临床最常用的中药之一，素有“十方九归”的说法，始载于《神农本草经》，被誉为“血家之圣药”[2]。当归广泛分布于甘肃、四川、陕西、湖北等地[3]。当归药材主要有效成分包括挥发油类、有机酸类、多糖、核苷类、脑苷类、氨基酸等多种类型的化合物，由复杂成分体系构成[4]。不同产地当归药材所含化合物含量高低各异，而不同化合物可通过多靶点、多途径对机体综合调控，进而发挥不同的药理作用。

课题组前期相关研究成果表明，甘肃产区当归(以下称：陇产当归)中含有高含量挥发油类成分，即该类成分的含量与其他产区比较差异有统计学意义(P<0.05)[5]。当归挥发油作为当归的主要药效成分之一，其组分十分复杂，主要含有藁本内酯、正丁烯内酯、当归酮等多种成分，具有广泛的药理活性[6]。近年来，当归挥发油在心血管系统、消化系统、呼吸系统、脑神经系统和抗肿瘤方面的相关研究成果不断涌现[7]。本研究运用网络药理学方法探寻陇产当归的特征性高含量化学成分群-挥发油类成分作用的关键靶点和信号通路，预测相关疾病并构建成分-靶点-疾病网络，为陇产当归挥发油类成分的药理作用机制研究提供依据[8-9]。

1 资料与方法

1.1 软件与数据库 应用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)、UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)、Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、STITCH数据库(http://stitch.embl.de/)、Swiss数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)、Omicshare数据平台(https://www.omicshare.com/tools/)、ctd数据库(Comparative Toxicogenomics Database，http://ctdbase.org/)、Cytoscape 3.7.0软件。

1.2 获取化学成分与ADME参数 本研究基于前期实验结果，针对陇产当归开展研究，选取其特征性高含量化学成分群藁本内酯(Ligustilide)、正丁基苯酞(3-n-Butylphthalide)、正丁烯基苯酞(3-Butylidenephthalide)作为目标成分，并借助TCMSP获取目标成分的吸收、分布、代谢、排泄(ADME)参数[10]。

1.3 化学成分潜在靶点预测与筛选 Pubchem数据库获取化合物Ligustilide、3-n-Butylphthalide和3-Butylidenephthalide的SMILES格式文件[11]，并将其上传至STITCH数据库和Swiss数据库，靶点种类设置为Homo sapiens，获取靶点后利用UniProt数据库的UniProtKB功能，设置限定物种Human，输入靶点名称以获取对应基因名称并进行蛋白名称矫正，最终得到各化合物相关靶点(Target)、基因(Gene)名称、UniProt ID、匹配概率(Probability)等结果。

1.4 成分-靶点-疾病网络构建 Cytoscape 3.7.0软件构建陇产当归特征性高含量化学成分群Ligustilide、3-n-Butylphthalide和3-Butylidenephthalide的相关“目标成分-靶点”网络；将目标成分相关靶点导入CTD数据库预测相关疾病，选取基因频数(Annotated Genes Quantity)≥10的疾病，构建“靶点-疾病”网络。运用Cytoscape-Merge功能合并“目标成分-靶点”与“靶点-疾病”网络，构建“目标成分-靶点-疾病”网络，以目标成分、靶点蛋白和疾病为3类节点(Node)，节点间相互关系用边(Edge)表示。再运用Cytoscape-Network Analyzer功能进行网络拓扑分析,以度(Degree)值反映节点大小,以边介数(Betweenness)反映边的粗细。

1.5 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 利用UniProt数据库中Retrieve/ID mapping功能，将所得靶点名称UniProt ID转换为Ensembl格式，并以Ensembl基因名形式将活性成分的相关靶点基因列表导入Omicshare数据平台，进行GO富集分析以预测靶点的功能分布，物种勾选“Homo sapiens genes”,对生物过程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function)、细胞组分(Cellular Component)进行全面富集分析，设置P值<0.01；以标准基因名形式将靶点基因导入CTD数据库，进行通路富集分析，设置P值<0.01，分析结果用以挖掘陇产当归特征性高含量成分群多维药理作用机制。

2 结果

2.1 预测目标成分靶点 本研究选取藁本内酯、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞为目标成分。在STITCH数据库和SWISS数据库共得到ALOX5、P18054、SLC6A2、HRH3、MAPT、MBNL1等36个靶点。见表1。

表1 陇产当归特征性高含量成分群潜在靶点

2.2 成分-靶点-疾病网络构建与分析 按相关靶点基因频数(Annotated Genes Quantity)由高到低排序，选取基因频数不小于10的16种疾病，构建目标成分-靶点-疾病网络模型，网络节点按网络节点度(Degree)排序，共包含55个节点(3个目标成分、36个靶点、16种疾病)。见图1。

图1 成分-靶点-疾病相互作用网络

2.3 生物功能与通路分析

2.3.1 GO富集分析 结果显示，靶点在生物过程中，细胞过程、生物调控和应激反应占比例较大；在分子功能中，分子结合、催化活性和转运活性作用突出；在细胞组分中，细胞部件、细胞膜、细胞器和膜部件较重要。见图2。

图2 目标成分GO富集分析结果

2.3.2 信号通路富集分析 结果显示，目标成分预测出的36个靶点中有24个靶点(67%)富集得到26条相关信号通路，涉及5种类别：其中与小分子转运相关的通路有4条，与信号转导相关的通路有7条，与机体系统相关的通路有6条，与新陈代谢相关的通路有7条，与疾病相关的通路有2条。见表2，图3～4。

图3 目标成分相关靶点通路富集分析结果

图4 成分-靶点-疾病相互作用网络

表2 目标成分相关通路的分类及信息

3 讨论

中药材的物质基础即其所含有效活性成分，从生物学角度来看，药材原植物品种的形成是基因型与产地环境相互作用的结果。药材药效与其产地密切相关，唐代《新修本草》曰：“离其本土，则质同而效异。”[12]不同地域生态系统各异，不同生态系统所孕育药材在有效成分含量及药效方面也存在差异[13]。关于药材所含化合物与其产地的相关性研究，长期以来被中药资源学领域视为研究热点，然而针对不同产地药材药理学相关的实验研究很少，究其缘由是中药化学成分组成十分复杂[14]。不同产地的药材含有活性成分的含量高低各异，而不同活性成分通过多靶点、多途径综合调控，进而发挥不同的药理作用，因此，开展不同产区药材药理学相关研究非常困难，需从不同产区、不同药理作用多维角度开展大规模的筛选实验。本课题组前期研究中完成了科研文献中不同产区当归药材成分含量数据的整合，运用主成分分析、聚类分析和单因素方差分析方法进行多指标综合评价，获取了陇产当归的特征性高含量化学成分群。本研究基于网络药理学方法寻找不同产区药材的特征性高含量成分群所对应的靶点、信号通路和疾病，将网络药理学的研究方法应用到中药资源学领域，可解决当前中药资源学与药理学领域交叉相关研究面临的难题，为我国不同产地中药资源药理作用机制的相关研究提供有力支撑。

课题组前期研究针对甘肃、四川、湖北、陕西、云南、河北6个产区栀子药材中的10种化学成分含量数据，综合运用主成分分析、聚类分析和单因素方差分析方法进行多指标综合评价，结果显示：1)甘肃产区当归中总挥发油含量与其他产区比较差异有统计学意义(P<0.05)；2)甘肃产区当归中挥发油类成分藁本内酯、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞含量与其他产区比较差异有统计学意义(P<0.05)，构成甘肃当归的特征性高含量化学成分群。

本研究基于前期实验结果，针对陇产当归药材进行研究，选取其特征性高含量化学成分群藁本内酯、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞作为目标成分，利用STITCH和SWISS数据库预测目标成分相关靶点，并将得到的36个靶点导入CTD数据库预测相关疾病[15]。结果靶点节点中PLAU、ALOX5、ESR1、AR、CYR19A1、STAT3这6个靶点排次靠前，是网络中枢纽节点，表明其可能为目标成分作用的核心靶点；疾病节点中，神经系统疾病、心血管疾病、肿瘤、免疫系统疾病以及消化系统疾病的网络节点度(Degree)值排次靠前，表明陇产当归药材特征性高含量成分群藁本内酯、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞可能通过LAU、ALOX5、ESR1、AR、CYR19A1、STAT3等36个潜在靶点对神经系统疾病、心血管疾病、肿瘤、免疫系统疾病以及消化系统疾病发挥相关药理作用。即：在中药资源学领域，针对陇产当归栀子药效学实验研究，应先从抗神经系统疾病、抗心血管疾病、抗肿瘤、调节免疫系统疾病以及抗消化系统疾病几方面入手；相关药理作用机制的实验研究，可从LAU、ALOX5、ESR1、AR、CYR19A1、STAT3等36个潜在靶点入手。

为进一步深入挖掘陇产当归特征性高含量化学成分群的多维药理作用机制，进而为靶点生物功能及信号通路相关实验研究提供科研依据，本研究还进行了GO富集分析和通路富集分析，结果显示，靶点基因数目较高的信号通路主要包括：Na+/Cl-神经递质转运蛋白(Na+/Cl-Dependent Neurotransmitter Transporters)、SLC介导的跨膜转运(SLC-Mediated Transmembrane Transport)、5-羟色胺能突触(Serotonergic Synapse)、花生四烯酸代谢(Arachidonic Acid Metabolism)、白介素信号(Signaling by Interleukins)、催乳素信号通路(Prolactin Signaling Pathway)；雌激素信号途径(Estrogen Signaling Pathway)等。这些信号通路中，Na+/Cl-神经递质转运蛋白可通过电化学梯度来驱动神经递质从突触摄取到神经元和胶质细胞的细胞质，从而终止突触传递。这些转运蛋白是治疗性和非法化合物的靶点，它们的功能障碍与神经系统的多种疾病有关[16]。SLC介导的跨膜转运的作用是调节细胞外溶质浓度的水平。在中枢和外周神经系统中，这些转运蛋白可以调节神经元间的信号转导，其中一些蛋白质的自然突变与各种神经系统疾病有关[17]。5-羟色胺能突触在学习记忆、情绪、睡眠、疼痛、运动功能和内分泌等生理功能以及异常情绪、认知等病理状态中发挥重要作用；花生四烯酸代谢可通过多种途径影响肿瘤的生长和转移[18]。白细胞介素信号及催乳素信号通路与免疫系统疾病密切相关[19]。雌激素信号途径与肿瘤疾病及靶向药物研究密切相关[20]。

研究结果从网络药理学角度揭示了陇产当归药材特征性高含量成分群相关靶点、关键生物通路以及主要相关疾病，将网络药理学相关技术应用到中药资源学领域的研究中，为我国不同产区中药材多维药理机制的相关研究奠定基础。