基于网络药理学研究黄芩汤对小鼠溃疡性结肠炎及相关癌症的保护作用

张旖晴 魏 玮 程 遥 苏晓兰 王 晨 刘 涛 许爱丽

(中国中医科学院望京医院脾胃病科，北京，100102)

网络药理学强调对信号通路的多通路调节，提高药物的治疗效果，降低毒性和不良反应，从而提高新药临床试验的成功率，并降低药物研发的成本[1]。中药及其处方具有多成分、多途径、多目标的特点，在疾病的预防和控制上具有优势。但是，由于中药的作用机制难以量化，其科学性受到质疑[2]。近年来，网络药理学已被认为是理解化合物配方的一种有效方法[3]。有研究通过网络药理学分析了血府逐瘀汤和复方丹参配方，并阐明了该配方中的主要活性成分和治疗机制[4]。因此，网络药理学有望破译黄芩汤的活性化合物和可能的机制[5]。

溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)是一种慢性进行性免疫学介导的疾病，可引起结肠的连续黏膜炎症[6]。UC的发病最常见于成年期，其特征是均匀且连续的病变[7]。UC多发于西欧和北美地区发达国家，在亚洲发病率正逐年上升[8]。UC治疗旨在降低复发率，改善生命质量并最大程度减少与药物相关的不良事件[9]。UC的基本疗法是根据症状的严重程度决定的，通常为加强疗法[10]。面向中药的网络药理学为我们提供了一种通过药代动力学评估、网络/通路分析和靶标预测揭示中药分子机制的新颖方法[11]。本研究试图基于网络药理学揭示黄芩汤对小鼠溃疡性结肠炎及相关癌症保护作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 实验中使用成年雄性C57BL/6小鼠(6～8周龄，18～22 g)，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将动物饲养于标准环境条件下，温度20～25 ℃，在12 h的明暗循环中，小鼠可自由获取标准食物和水。本研究遵循《美国国家卫生研究院实验动物的管理和使用指南》，通过北京维通利华实验动物技术有限公司动物伦理委员会审批(伦理审批号：P2018027)。

1.1.2 药物 黄芩汤由黄芩9 g、白芍6 g、黄芪18 g、苦参9 g、地榆12 g、三七粉6 g、白及6 g、炙甘草6 g、大枣6 g组成，是清热止痢、和中止痛的经典方剂。所有中药均购自中国中医科学院望京医院中药房，由中药房统一煎煮而成。按处方比例取药材，按1∶10加入清水煎煮2次，煮沸30 min后过滤出上清液，浓缩成1 g/mL的煎煮液备用。

1.1.3 试剂与仪器 右旋糖酐硫酸钠36～50 G(Dextran Sulfate Sodium，DSS)(MP Biomedicals公司，美国，货号：BS09890)；Azoxymethane(Sigma公司，美国，货号A5486-25MG)；96孔酶标板(Corning公司，美国，货号：ANN6708)；聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜(Millipore公司，德国，货号：K5CA1690G)；离心管(Axgen爱思进公司，美国，货号：CGH918-002)；无水乙醇(北京化学试剂厂，货号：A2015-0115B)；氯化钠(北京化学试剂厂，货号：A2017-1589X)；蛋白上样枪头(瑞舒生物科技有限公司，货号：BNM-09871)；抗体孵育盒(瑞舒生物科技有限公司，货号：BBG-121582)；蛋白上样缓冲液(碧云天生物技术研究所，货号：S2018-0530)；相关抗体(Abcam公司，英国，货号：CV90-DF1235)；纯水机(力康生物医疗科技控股有限公司，型号：Smart-N)；电热恒温水箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号：CU-420)；离心机(Sigma公司，美国，型号：D-37520 1-14K)；分析天平(Sartorius公司，德国，型号：BS124S)；超微量紫外分光光度计(赛默飞世尔公司，美国，型号：NanoDrop)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 分组：根据小鼠体质量采用2016版Excel中的Rand函数将小鼠随机分为对照组15只，诱导组15只，黄芩汤组15只；肿瘤诱导组15只，黄芩汤+肿瘤组15只，第11天处死小鼠，检查其免疫组化及肿瘤个数和肿瘤大小。模型制备：通过在饮用水中添加3%硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS)(w/v)，在C57BL/6小鼠中诱导UC7 d。在研究期间，模型动物每天给予黄芩汤灌胃，而未治疗的动物作为对照组，每隔1 d更换新鲜制备的DSS溶液，每天监测体质量，并观察粪便和身体活动。7 d后，将小鼠用CO2安乐死，并收集脾脏和结肠进行测量。对于肿瘤的诱导，如前所述诱导结肠炎相关的癌症(Colitis-associated Carcinoma,CAC)，按体质量对小鼠腹膜内注射偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)，10 mg/kg，并用常规水和饮食维持7 d。对小鼠进行2个DSS处理周期，每个周期由3% DSS组成，持续7 d，用普通水恢复14 d。

1.2.2 给药方式 整个实验过程中黄芩汤+肿瘤组每天给小鼠黄芩汤灌胃。在实验结束时，使用解剖显微镜对小鼠结肠肿瘤进行计数和测量。黄芩汤组以20 g/kg给药量灌胃给药，1次/d。其余各组小鼠均予以等量生理盐水灌胃干预。

1.2.3 实验方法

1.2.3.1 样品采集 取出小鼠胃肠道进行测量，清空内容物并称重。将肠段(2 cm)浸入10%甲醛缓冲液中进行组织学分析。收集与相应组织学样品相邻的肠段(2 cm)，在液氮中速冻并储存于80 ℃冰箱中用于生化分析。切除结肠段，除去黏附的脂肪组织，用生理盐水冲洗，以除去粪便残留物，吸干并测量。收集结肠用于苏木精-伊红(Hematoxylin Eosin，HE)染色，并收集血清用于测量髓过氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)。

1.2.3.2 组织分析及评分 DSS诱发的结肠炎结肠镜损伤评分如下：0正常结肠组织；1仅限于黏膜的炎症或局灶性溃疡；2局限性或广泛性溃疡和炎症仅限于黏膜和黏膜下层；3局灶性或广泛性溃疡和炎症受固有肌层的限制；4局限性或广泛性溃疡和炎症伴浆膜受累；5广泛的溃疡和透壁炎症与浆膜相关。宏观观察后，将结肠组织固定在4%多聚甲醛中，脱水、包埋在石蜡中，最后切成4 μm厚的切片，用于组织学评价的标准程序。

1.2.3.3 结肠组织的免疫组织化学分析 5 μm厚的石蜡切片用于免疫组织化学实验。为回收抗原，将样品置于柠檬酸溶液(pH=9.0)中，并在微波炉中加热10 min。随后，将切片与无动物的封闭溶液一起孵育1 h，与F4/80单克隆抗体在4 ℃温度下孵育过夜。之后，将切片用二抗标记2 h。3′-二氨基联苯胺用于产生褐色信号，苏木精用作复染。通过显微镜使免疫组织化学图像可视化，并通过Image-Pro Plus软件进行分析。

1.2.3.4 MPO测定 MPO活性是通过检测嗜中性粒细胞浸润来指示急性炎症的指标。将中结肠(2 cm)的样品在10 mL磷酸钾缓冲液(750 mL)中匀浆并离心(13 000×g，离心半径13 cm，持续12 min)，弃去上清液，并将剩余的组织重悬于200 mL 0.5%十六烷基三甲基溴化铵缓冲液。将反应溶液(4.2 mg的O-二苯胺二盐酸盐试剂，12.5 mL的过氧化氢，2.5 mL pH 6.0的磷酸钾缓冲液和22.5 mL的蒸馏水)加入板中(200 mL/孔)并改变吸光度(450 nm)，用分光光度计每隔1 min进行测量，共15 min，数据表示为每克组织MPO的单位。

1.2.3.5 数据和疾病活动指数 每天监测和记录小鼠体质量和液体摄入量。每天使用疾病活动指数的4个参数(体质量减轻、直肠出血、粪便稠度和总体状况)对UC的严重程度进行评分。每个参数的评分为0-3(严重程度越高，分值越高)。

1.2.3.6 白细胞培养计数 在补充了10%胎牛血清、100 U/mL氨苄青霉素和100 mg/mL链霉素的培养基中，将THP-1细胞维持在5% CO2、37 ℃的潮湿环境中。当细胞达到80%浓度时，以1×106个细胞/孔的密度接种在6孔细胞培养板中，并用各种浓度的奥罗西汀(12.5 μmol/L、25 μmol/L和50 μmol/L)处理2 h。加入1 μg/mL细菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，并将细胞再孵育24 h。

1.2.3.7 网络药理学的生物活性化预测 加权集成相似度算法通过大规模的药物靶标关系被用于预测生物活性化合物的直接靶标。本研究中将可能性得分≥7的目标作为直接目标，将目标映射到UniProt数据库中进行注释和标准化。通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP,http://tcmspw.com/)检索黄芩汤配方中所有草药的类药性(Drug Likeness，DL)，筛选出生物活性化合物。通过集成模型预测和筛选黄芩汤中潜在的生物活性化合物。通过OBioavail 1.1获得口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)值，并选择OB≥30%的化合物进行进一步分析。

2 结果

2.1 黄芩汤主要药用成分筛查 对以黄芩汤为基础的加味黄芩汤主要药用成分进行活性检测，分析得到黄芩、芍药、黄芪、苦参、地榆、三七、甘草、大枣等成分和多种活性化合物。通过数据库并根据OB、DL阈值，共检索到加味黄芩汤主要活性化合物282个：黄芩36个、芍药13个、黄芪19个、苦参45个、地榆35个、三七9个、白及4个、甘草92个、大枣29个。将结果进行OB值排序，黄芩中的黄芩新素、榄核莲黄酮、5,7,4′-三羟基-8-甲氧基黄烷酮、黄芩黄酮，芍药中的芍药吉酮、芍药苷，黄芪中的异黄酮、7-O-甲基异丙醇胺、刺芒柄花素、叶酸，苦参中的苦参醇、叶立酮、苦参酚，地榆中的没食子酸、儿茶素、鞣花酸等鞣质类成分以及地榆皂苷，三七中的槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、人参皂苷rh2，白及中的2,3,4,7-四甲氧基菲、甘草中的甘草酚、甘草吡喃香豆酮、甘草查尔酮B，大枣中的穆坪马兜铃酰胺等成分的OB值较高，表明这些成分在加味黄芩汤中的活性较高，也体现了加味黄芩汤多成分、多靶点的药物特征。

2.2 黄芩汤改善了DSS诱导的UC 诱导组较对照组小鼠体质量和结肠长度降低(P<0.05)，黄芩汤组较诱导组中小鼠体质量和结肠长度升高(P<0.05)，黄芩汤可改善DSS诱导的小鼠UC，对小鼠结肠具有一定的保护作用。见图1，表1。

图1 小鼠结肠长度比较

表1 2周后小鼠体质量及结肠长度测量

2.3 黄芩汤降低小鼠UC的炎症反应 诱导组较对照组白细胞含量、脾脏指数升高(均P<0.05)，黄芩汤组较诱导组白细胞含量、脾脏指数降低(均P<0.05)，黄芩汤可降低小鼠的炎症反应。见表2。

表2 小鼠炎症水平检测

2.4 黄芩汤降低结肠炎组织损伤评分 诱导组较对照组结肠损伤评分、组织学评分升高(均P<0.05)，黄芩汤组较诱导组肠损伤评分、组织学评分降低(均P<0.05)，说明黄芩汤可保护结肠的组织损伤。对照组结肠组织未出现病理变化和巨噬细胞浸润；诱导组结肠组织出现水肿等损伤性反应，并且可见大量巨噬细胞浸润；黄芩汤组结肠组织水肿减轻，巨噬细胞浸润减少。发现黄芩汤能够抑制结肠组织的病理变化和巨噬细胞浸润，及黄芩汤对UC的保护作用。见图2，表3。

图2 结肠组织的免疫组织化学分析(HE染色，×200)

表3 结肠组织评分

2.5 小鼠结肠髓过氧化物酶活性 诱导组较对照组MPO活性升高(P<0.05)，黄芩汤组较诱导组MPO活性降低(P<0.05)。见表4。

表4 MPO活性检测

2.6 黄芩汤有效抑制肿瘤事件的发生和发展 黄芩汤+肿瘤组较肿瘤诱导组肿瘤负荷、肿瘤大小都减小(P<0.05)。见图3，表5。

图3 小鼠结肠肿瘤

表5 小鼠肿瘤发生比较

3 讨论

UC的发生涉及遗传、生化、心理、社会和环境因素[12]。鉴于UC的复杂发病机制，单一靶标药物难以获得更好的治疗效果，而多靶点联合药物治疗已成为未来UC治疗的趋势。中医药由于多靶点作用，已成为UC治疗药物的重要来源。通过从整体的角度探讨药物与疾病之间的关系为中药研究提供了新的策略[13]。黄芩汤是重要的传统中药处方，已广泛用于抗炎、止痛和免疫调节[14]。ADME是药物“吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代谢(Metabolism)和外排(Excretion)”的简称，代表药物进入机体后机体对药物的处置过程。本研究根据ADME特性进行初步筛选后，筛选出126种潜在的黄芩汤生物活性化合物。研究表明，黄芩汤对UC的治疗作用可以通过多种途径的协同或者累加作用发挥抗炎作用。

黄芩汤处方在中国已经用于治疗胃肠道疾病，包括恶心、呕吐、腹泻和腹部绞痛已有一千多年的历史[15]。该配方草药中的主要活性成分是黄芩、芍药、甘草、大枣等三萜类皂苷衍生物和多糖[16]。研究表明，黄芩汤中某些化合物(如配方中的黄苷)对UC有影响。本研究证实，黄芩汤可用于预防和治疗UC。本实验结果表明，对小鼠进行DSS给药导致体质量减轻，并引起结肠组织的黏膜炎症，上皮缺失和巨噬细胞浸润。口服黄芩汤可减轻小鼠的体质量，并改善了结肠组织的病理变化和巨噬细胞浸润，从而证实了黄芩汤对UC的保护作用。但是，目前尚不明确黄芩汤中对UC发挥保护作用的特定生物活性单体。液质色谱-质谱法测定的药物组织分布是药理效力研究中的重要指标[17]。作为先天免疫细胞，巨噬细胞在保护人体免受UC期间腔内细菌的侵害中至关重要[18-19]。本研究发现黄芩汤可以缓解DSS引起的结肠炎症症状，减少血液和结肠中巨噬细胞的数量，而且还证明黄芩汤可以改善体内炎症细胞的浸润。

包括UC和克罗恩病在内的炎性肠病是一种慢性的特发性肠道的炎症性疾病，目前的治疗在很大程度上受到严重全身性不良反应的限制。在过去的十年中，炎性肠病的治疗选择是抗炎药(5-氨基水杨酸、类固醇激素)或免疫抑制剂[20]。尽管这些药物有效，但进一步应用受到其对免疫系统非特异性作用的限制，这些非特异性作用会导致短期和长期的免疫力下降，并发生过敏反应、恶心、肝酶升高、胰腺炎和其他威胁生命的不良反应。此外，局部活性最低且全身吸收最小的抗炎药(5-氨基水杨酸酯)需要频繁大剂量给药才能发挥可评估的临床功效。此外，尽管已经开发出了可将药物专门递送至结肠较长时间的持续药物释放装置，例如药丸、胶囊或片剂，但这些药物的治疗功效有限，仅对一部分炎性肠病患者有效。

综上所述，中医治疗UC等疾病具有较高疗效、低治疗成本和不良反应少的优势。本研究基于网络药理学发现黄芩汤对UC具有保护作用，可抑制炎症及肿瘤的发展。