大孔树脂-磁场辅助溶剂结晶联合纯化红松籽油甾醇的研究

王莉莉，包怡红，赵庆佳，张 娜，郭庆启,3

(东北林业大学林学院1，哈尔滨 150040) (哈尔滨商业大学食品工程学院2，哈尔滨 150028) (黑龙江省森林食品资源利用重点实验室3，哈尔滨 150040)

植物甾醇属于三萜烯化合物[1]，通常以游离甾醇或者由甾醇酯、甾醇糖苷和酰基化甾醇糖苷构成的结合甾醇形式广泛存在于各种坚果、种子和植物油中[2,3]，其主要为豆甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇以及饱和形式的甾烷醇。国内外研究发现，植物甾醇具有降血脂[4]、预防心血管疾病[5]、抗肿瘤[6]以及减肥[7]等作用，在食品、医药及化妆品等领域得到广泛应用。

目前有关植物甾醇提取的研究较多，主要有皂化法、超临界CO2萃取法、层析法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等[8-11]，来源于油脂的植物甾醇粗提物因含有色素、脂肪酸等使其黏度较大，影响了其纯度、功能以及综合利用。对于植物甾醇纯化的相关研究文献报道较少，甾醇类活性物质的纯化研究常采用分子蒸馏法、大孔树脂法、溶剂结晶法等，分子蒸馏法是在高真空条件下利用料液中分子蒸发速率的不同进行分离，此法操作复杂且物质的回收率较低[12]，大孔树脂法操作简便、纯化效率高，环保可重复利用[13]，溶剂结晶法即利用活性物质在某一溶剂中溶解度的不同从而使溶质达到过饱和状态而结晶析出，提高物质纯度，但需多次结晶后才可获得纯度较高的植物甾醇[14]；磁场辅助溶剂结晶即将传统的结晶过程置于磁场环境中，借助磁场强度、时间和方向作用对分子和原子的聚集状态、迁移速度和方向产生影响，增加物质间的碰撞机会，通过对结晶过程进行调控，有助于改善甾醇溶液的黏度、溶解度和表面张力，实现促进晶核形成和改善晶体品质的目的。Gavira等[15]实验表明在磁场条件下会影响溶菌酶四方晶体的成核和生长，许凯云等[16]利用磁场诱导结晶分离薄荷醇碱，发现在磁场作用下结晶时间由10 h缩短至4 h。

本研究以红松籽油甾醇提取物为原料，以吸附率和解吸率为指标，筛选最佳树脂型号，通过静态及动态吸附与解吸实验，确定大孔树脂纯化红松籽油甾醇的最适工艺条件；再以纯度和结晶率为指标，二次分离纯化红松籽油甾醇，确定纯化工艺参数；最后通过光谱、气-质等技术对红松籽油甾醇的结构和组成进行表征和鉴定，以期为红松籽油甾醇的制备及利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红松(PineskoraiensisL.)籽、胆固醇标准品(纯度≥98%)、溴化钾(光谱纯)、甲醇(色谱纯)。

1.2 仪器与设备

TU1900紫外-可见分光光度计，Scientz-18N 冷冻干燥机，IS-RSDS台式恒温振荡器，DCT 23-15 可调式电磁铁，HT20 高斯计，FTIR-480 傅里叶变换红外光谱仪，7890-5973N 气质联用仪。

1.3 方法

1.3.1 红松籽油甾醇提取物的制备

参考刘海霞等[9]方法制备红松籽油甾醇粗提物。

1.3.2 红松籽油甾醇含量与纯度的测定

采用磷硫铁显色法进行甾醇含量的测定[17]，样品红松籽油甾醇含量以胆固醇质量计，mg/mL。以胆固醇质量浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，方程为y=4.910 5x-0.000 7，R2=0.999。按式(1)计算甾醇纯度。

(1)

式中：C为红松籽油甾醇含量/mg/mL；V为红松籽油甾醇溶液体积/mL；m为红松籽油甾醇质量/mg。

1.3.3 大孔树脂初次纯化红松籽油甾醇的研究1.3.3.1 大孔树脂的筛选

取预处理后的树脂2.00 g，加入30 mL红松籽油甾醇提取液(0.15 mg/mL)，120 r/min、25 ℃振荡吸附12 h后过滤，测定吸附液中红松籽油甾醇含量。将树脂用蒸馏水洗净，用滤纸吸干水分，加入30 mL无水乙醇溶液，120 r/min、25 ℃振荡12 h后过滤，测定解吸液中红松籽油甾醇含量，按照式(2)～式(4)分别计算甾醇的吸附率、吸附量和解吸率。

(2)

(3)

(4)

式中：C0为红松籽油甾醇初始含量/mg/mL；C1为吸附液中红松籽油甾醇含量/mg/mL；C2为解吸液中红松籽油甾醇含量/mg/mL；V1为吸附液体积/mL；V2为解吸液体积/mL；m1为树脂的质量/g。

1.3.3.2 AB-8树脂对红松籽油甾醇静态吸附及解吸动力学研究

取AB-8树脂2.00 g，加入30 mL甾醇提取液，120 r/min、25 ℃振荡吸附12 h，每1 h测定吸附液中甾醇含量。吸附结束后，过滤，将吸附饱和的树脂用蒸馏水洗净，加入30 mL无水乙醇进行解吸，于120 r/min、25 ℃振荡解吸12 h，每1 h测定解吸液中甾醇含量。

1.3.3.3 AB-8树脂静态/动态吸附及解吸对甾醇纯化效果影响的研究

取2.00 g AB-8树脂湿法上柱，考察甾醇上样质量浓度、乙醇体积分数、吸附流速、甾醇上样量、解吸流速、解吸液体积对红松籽油甾醇纯化效果的影响。

1.3.4 磁场辅助溶剂结晶二次纯化红松籽油甾醇的研究

将大孔树脂纯化的红松籽油甾醇初次纯化液在45 ℃条件下真空旋转蒸发，真空冷冻干燥。称取一定质量的红松籽油甾醇，按一定料液比加入结晶溶剂，回流加热至溶解，趁热过滤，冷却至室温。室温条件下在固定磁场强度的磁场中结晶1 h，置于某一温度下养晶一段时间，过滤，取少量溶剂冲洗滤渣，滤渣烘干后密封保存。考察结晶溶剂、料液比、养晶温度、养晶时间对红松籽油甾醇纯化效果的影响，按式(1)、式(5)计算红松籽油甾醇纯度和结晶率。

(5)

式中：m3为称取的大孔树脂纯化后的甾醇质量/g；m4为结晶后的甾醇质量/g；P1为大孔树脂纯化后甾醇的纯度/%；P2为结晶后甾醇的纯度/%。

1.3.5 红松籽油甾醇的鉴定分析

1.3.5.1 红松籽油甾醇的紫外-可见光谱扫描分析

取少量红松籽油甾醇，用甲醇溶解，利用紫外-可见分光光度计进行全波长扫描，确定最大吸收波长。

1.3.5.2 红松籽油甾醇的红外光谱扫描分析

称量干燥后的红松籽油甾醇样品1 mg，称取烘干后的KBr 100 mg，研磨混合均匀后，压片，采用红外光谱透射法进行扫描。

1.3.5.3 红松籽油甾醇的GC-MS鉴定分析

样品前处理方法参考彭丽霞等[17]的方法。GC条件：DB-5 ms柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度为260 ℃；载气为He，分流进样，分流比为30∶1；恒定流速1 mL/min，采用升温程序，初始温度230 ℃保持2 min；以2 ℃/min升至250 ℃，保持45 min。

MS条件：接口温度280 ℃，溶剂延迟3 min，EI离子源，离子源温度230 ℃，电子能量70 eV，四级杆温度150 ℃，质量扫描范围50～500 amu。

1.4 数据统计与分析

数据结果采用平均值±标准差表示，使用SPSS 24.0、Excel 2010与Origin 2018软件进行图表绘制及数据分析。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂静态吸附及解吸实验对红松籽油甾醇纯化效果的影响

2.1.1 大孔树脂型号对红松籽油甾醇纯化效果的影响

根据极性不同选取了NKA-9(极性)、NKA-Ⅱ(极性)、AB-8(弱极性)、D-101(非极性)、S-8(非极性)5种大孔树脂纯化红松籽油甾醇，其纯化效果如表1所示。AB-8和D-101树脂的吸附能力较强，NKA-9的吸附效果最差，D-101树脂的解吸率显著低于AB-8(P<0.05)。张冬阳等[18]利用AB-8、D-101、DA-201树脂纯化薏米中β-谷甾醇，发现AB-8树脂对β-谷甾醇的纯化具有显著效果，大孔树脂的吸附与解吸能力与其本身的极性、比表面积和孔隙结构有关，因此选择AB-8树脂纯化红松籽油甾醇。

表1 大孔树脂静态吸附与解吸效果

2.1.2 静态吸附时间与甾醇浓度对红松籽油甾醇纯化效果的影响

吸附时间与甾醇浓度对红松籽油甾醇纯化效果的影响结果如图1所示。AB-8树脂在吸附红松籽油甾醇过程中，吸附率随时间的增加呈先升高后平缓的趋势，在0～3 h范围内吸附率快速上升，3 h后树脂吸附趋于平衡，表明AB-8树脂可快速吸附红松籽油甾醇，3 h内达到吸附基本达到饱和，故选择吸附时间为3 h。

红松籽油甾醇溶液因含有较多色素和脂肪酸，上样质量浓度越高杂质含量越大，溶液黏度增大，会争夺AB-8树脂中的活性位点，增加树脂对杂质的吸附效果，占据树脂空隙，导致甾醇吸附率降低。当红松籽油甾醇上样质量浓度较低时所含甾醇含量较小，吸附动力小，吸附率低。合适的上样质量浓度使红松籽油甾醇与树脂充分接触，提高树脂利用率，故选择红松籽油甾醇的上样质量浓度为0.2 mg/mL。

注：图中小写字母的不同表示差异显著(P<0.05)，下同。图1 吸附时间与甾醇浓度对红松籽油甾醇纯化效果的影响

2.1.3 静态解吸时间与乙醇体积分数对红松籽油甾醇纯化效果的影响

解吸时间与乙醇体积分数对红松籽油甾醇纯化效果的影响结果如图2所示。解吸是为了将吸附在树脂中的红松籽油甾醇分离出来，而解吸液是一种更易与大孔树脂相结合的物质，可以减弱树脂与红松籽油甾醇的相互作用力，使红松籽油甾醇更易释放出来。在0～4 h范围内，红松籽油甾醇的解吸率快速上升，4 h后达到平衡，此后解吸率变化趋于平稳，因此选择解吸时间为4 h。

乙醇体积分数在50%～80%范围内，解吸率随乙醇体积分数的增大而增大，大孔树脂遵循相似相溶原则，AB-8树脂属于弱极性树脂，树脂的吸附性与范德华力和氢键有关，极性越相似范德华力越大[19]，乙醇的体积分数越小，极性越大，不利于红松籽油甾醇的解吸，乙醇体积分数越大，极性变弱，接近AB-8树脂的极性，故解吸效果越强[20]。当乙醇体积分数大于80%时，醇溶性杂质被解吸出来，导致红松籽油甾醇的解吸率下降，故选择体积分数80%的乙醇溶液解吸红松籽油甾醇。

图2 解吸时间与乙醇体积分数对红松籽油甾醇纯化效果的影响

2.2 动态吸附及解吸实验对红松籽油甾醇纯化效果的影响

2.2.1 吸附流速与解吸流速对红松籽油甾醇纯化效果的影响

吸附流速与解吸流速对红松籽油甾醇纯化效果的影响，结果如图3。合适的吸附流速节省时间同时可提高效率，吸附流速为2 mL/min时吸附率最大(P<0.05)，为(88.44±3.52)%，吸附流速较慢时，红松籽油甾醇可与树脂充分接触，扩散至树脂孔隙内部，但试验周期长效率低，吸附流速快，树脂与红松籽油甾醇作用时间短，导致红松籽油甾醇未被吸附便已泄漏[21]，因此选择吸附流速为2 mL/min。

图3 吸附流速与解吸流速对红松籽油甾醇纯化效果的影响

解吸流速越快，导致乙醇溶液未充分扩散至树脂内部便已流出，并未溶解出红松籽油甾醇，故解吸效果差，而解吸流速较慢时，醇溶性杂质被带出，纯化效果不佳，实验时间长[22]，因此选择解吸流速为2 mL/min。

2.2.2 红松籽油甾醇上样量对纯化效果的影响

甾醇上样质量浓度为0.2 mg/mL，以2 mL/min流速收集流出液，每5 mL 为一个流分，测定每个流分中的甾醇含量，以泄漏点为指标，泄漏曲线如图4所示。以流出液中红松籽油甾醇的质量浓度达到上样液中红松籽油甾醇质量浓度的十分之一为泄漏点[23]，当流出液中甾醇的浓度达到泄漏点时，表明树脂已吸附饱和。第6个流分中红松籽油甾醇质量浓度为0.023 mg/mL，即上样量为30 mL时，红松籽油甾醇已达到泄漏点，上样量较小，树脂不能充分利用，未吸附红松籽油甾醇的树脂活性位点易被杂质占据，导致纯化效果下降[24]；上样量较大，树脂吸附饱和后造成原液中红松籽油甾醇大量流失，故选择30 mL为红松籽油甾醇的最佳上样量。

图4 泄漏曲线

2.2.3 解吸液体积对红松籽油甾醇纯化效果的影响

取2.00 g吸附饱和的树脂，用80%乙醇溶液以2 mL/min解吸，每5 mL为一个流分，测定每个流分中红松籽油甾醇含量，解吸液体积对红松籽油甾醇纯化效果的影响见图5。解吸液体积较小不能完全洗脱出红松籽油甾醇，解吸液体积较大，溶剂消耗大，且后期溶剂去除困难。第14个流分中红松籽油甾醇基本已经全部解吸出来，之后随着乙醇溶液的增加，红松籽油甾醇含量不再变化，最终红松籽油甾醇质量浓度降至0.01 mg/mL并趋于平稳，故选择解吸液体积为70 mL。

本研究中，大孔树脂纯化红松籽油甾醇的最佳工艺：选择AB-8树脂、上样质量浓度0.2 mg/mL，上样量30 mL，吸附流速2 mL/min，吸附时间3 h，解吸液乙醇体积分数80%，乙醇体积70 mL，解吸流速2 mL/min，解吸时间4 h，此条件下红松籽油甾醇纯度为(45.32±2.13)%。

图5 洗脱曲线

2.3 磁场辅助溶剂结晶二次纯化红松籽油甾醇的研究

2.3.1 结晶溶剂对红松籽油甾醇纯化效果的影响

称取红松籽油甾醇，加入不同结晶溶剂，轻微加热直至甾醇全部溶解，冷却至室温，置于磁场中结晶，当溶液中甾醇含量不再变化时表明结晶结束，养晶温度-7 ℃，养晶时间5 h条件下，结晶溶剂对红松籽油甾醇纯化效果的影响如图6、图7所示。利用高斯计测定磁场强度为0.3 T，磁场可促进晶体的成核速率，加快晶体生长速度。纯度较高的植物甾醇为白色晶体，粗甾醇因含有色素及脂肪酸，使其黏度较大为黄色膏状体，不宜使用活性炭脱色，经大孔树脂纯化后的红松籽油甾醇呈淡黄色，故使用有机溶剂继续来萃取色素和脂肪酸。

图6 不同溶剂中红松籽油甾醇结晶效果图

注：纯度之间差异显著性(P<0.05)用不同小写字母表示；结晶率之间差异显著性(P<0.05)用不同大写字母表示；下同。图7 结晶溶剂对红松籽油甾醇纯化效果的影响

不同溶剂中红松籽油甾醇结晶效果如图6所示，红松籽油甾醇在无水乙醇中结晶颗粒颜色为白色，而在其他4种溶剂中结晶颗粒表面泛黄，在异丙醇中结晶颗粒粗大，在正己烷中呈絮状，在无水乙醇和丙酮中结晶颗粒较为均匀，且结晶速度较快，在甲醇中结晶颗粒细小而轻薄。由图7可知异丙醇和无水乙醇作为结晶溶剂时，红松籽油甾醇的纯度差异不显著，但异丙醇的结晶率较低，而无水乙醇和丙酮的结晶率较高，可能是植物甾醇在丙酮试剂中溶解度变化较大，析出晶体较多，但丙酮结晶出的甾醇纯度较低，故选择无水乙醇为结晶溶剂。以无水乙醇为结晶溶剂，无磁场条件下红松籽油甾醇结晶率为(30.39±0.54)%，纯度为(54.25±2.13)%，对比表明，磁场辅助溶剂结晶纯化红松籽油甾醇可使其纯度提高20.86%。

2.3.2 料液比对红松籽油甾醇纯化效果的影响

以无水乙醇为结晶溶剂，养晶温度-7 ℃，养晶时间5 h时，料液比对红松籽油甾醇纯化效果的影响如图8所示。

图8 料液比对红松籽油甾醇纯化效果的影响

当料液比为1∶10 时红松籽油甾醇的纯度和结晶率均最大(P<0.05)，在结晶体系中，料液比越大过饱和度越小，晶核更易于形成，晶体依附晶核生长，形态较好且纯度更高，但因晶体生长缓慢，甾醇结晶率较低。料液比越小，饱和度越大，体系传质阻力增大，晶体不规则生长且速率加快，结晶率升高，但不规则生长会包裹杂质导致纯度降低[25]。

2.3.3 养晶温度对红松籽油甾醇纯化效果的影响

以无水乙醇为结晶溶剂，料液比1∶10 ，养晶时间5 h时，养晶温度对红松籽油甾醇纯化效果的影响如图9所示。

养晶温度为5 ℃时，红松籽油甾醇的纯度(80.48±2.10)%及结晶率(35.00±0.90)%均最大(P<0.05)，温度为-18 ℃，杂质析出较多，纯度为(53.65±1.52)%。田燕等[26]研究表明0 ℃左右各种甾醇均会结晶析出，而室温或高于室温，高纯度的谷甾醇结晶析出，但得率低。彭超等[27]均在5 ℃条件下结晶，植物甾醇纯度为97.72%。

图9 养晶温度对红松籽油甾醇纯化效果的影响

2.3.4 养晶时间对红松籽油甾醇纯化效果的影响

以无水乙醇为结晶溶剂，料液比1∶10，养晶温度5 ℃，养晶时间对红松籽油甾醇纯化效果的影响如图10所示。

红松籽油甾醇的结晶率和纯度都随着时间延长呈先升高后下降的趋势，养晶时间4 h纯度(83.12±2.10)%和结晶率(39.00±0.51)%最大(P<0.05)，之后随时间延长，晶核表面附着杂质越多，纯度明显降低，田燕等[26]认为养晶时间长会降低生产效率，不利于实际生产，因此选择养晶时间为4 h。

因此，利用磁场辅助溶剂结晶二次纯化红松籽油甾醇的最佳工艺为：磁场强度0.3 T，无水乙醇为结晶溶剂，料液比1∶10 ，养晶温度5 ℃，养晶时间4 h。此条件下红松籽油甾醇纯度为(83.12±3.24)%。

图10 养晶时间对红松籽油甾醇纯化效果的影响

2.4 红松籽油甾醇的结构鉴定

2.4.1 红松籽油甾醇紫外-可见光谱扫描分析

利用甲醇将粗甾醇和二次纯化后的红松籽油甾醇溶解，于紫外-可见分光光度计进行扫描，所得图谱如图11所示，红松籽油甾醇纯化物的甲醇溶液在211 nm处有1个强吸收峰，粗提物在212 nm处有1个强吸收峰，符合植物甾醇的特征吸收峰[28]，粗提物可能含有杂质，使曲线有拖尾现象。

图11 红松籽油甾醇的紫外吸收曲线

2.4.2 纯化后红松籽油甾醇的红外光谱扫描分析

植物甾醇是以环戊烷多氢菲(3个环己烷和1个环戊烷稠合而成)为骨架及3个侧链而构成，R1和R2一般为甲基，R3一般为多碳链构成，且C3位为羟基。二次纯化后的红松籽油甾醇的红外光谱扫描结果如图12所示，3 341 cm-1处有谱带较宽的羟基(—OH)振动峰，2 941 cm-1为甲基(—CH3)振动峰，2 868 cm-1为亚甲基(—CH2)振动峰，1 464 cm-1为甲基或亚甲基的不对称变形振动峰，1 376 cm-1为甲基的对称变形振动峰，1 058 cm-1为羟基键的变形振动峰，960 cm-1反式二取代烯烃的弯曲振动峰，839 cm-1为三取代烯烃的弯曲振动峰，800 cm-1为C—C单键伸缩振动峰，均符合植物甾醇的特征吸收峰[29]，而在1 750～1 725 cm-1处无明显的酯基振动峰，表明与脂肪酸相连的甾醇已完全游离出来。

图12 红松籽油甾醇的红外分析图谱

2.4.3 纯化后红松籽油甾醇种类及含量分析

以胆固醇为内标物，采用GC-MS对红松籽油甾醇种类及含量进行分析，内标法计算甾醇含量。结果如图13所示。保留时间为28.19、32.75、39.43、40.99 min的峰分别为芝麻素、菜油甾醇、β-谷甾醇、16-α-羟基孕甾烯醇酮，其含量分别为(7.13±0.15)、(33.37±0.13)、(153.12±0.24)、(53.38±0.16)mg/100 g，红松籽油甾醇总量为186.49 mg/100 g，且以β-谷甾醇为主。朱雪梅等[30]测得松籽油甾醇含量为141.64 mg/100 g。徐鑫等[31]测得松籽油甾醇含量为207.66 mg/100 g，菜油甾醇和谷甾醇分别为40.265、167.397 mg/100 g。

注：1～5分别表示胆固醇、芝麻素、菜油甾醇、β-谷甾醇、16-α-羟基孕甾烯醇酮。图13 红松籽油甾醇的GC-MS总离子图

3 结论

采用5种大孔树脂对红松籽油甾醇进行初步纯化，结果表明AB-8树脂更适用于红松籽油甾醇的纯化，在本实验最佳纯化工艺下，红松籽油甾醇纯度为(45.32±2.13)%。利用磁场辅助溶剂结晶法进行二次纯化后，红松籽油甾醇的纯度为(83.12±3.24)%。红松籽油甾醇经紫外-可见光谱扫描，在210 nm波长左右处有最大吸收峰，利用红外光谱扫描，在3 341、2 941、2 868、1 376、1 058、960、839、800 cm-1处出现了植物甾醇的特征吸收峰，经GC-MS鉴定出红松籽油中的2种植物甾醇，分别为β-谷甾醇和菜油甾醇，且β-谷甾醇占甾醇总量的80%以上。结果表明，采用大孔树脂联合磁场辅助溶剂结晶法可以有效的对红松籽油甾醇进行纯化，今后可进一步研究纯化后红松籽油甾醇的功能性质以及磁场对结晶效果影响机理。