肝细胞癌中糖异生代谢异常的研究进展

罗赛芳， 马向明， 曹立瀛

华北理工大学附属开滦总医院 肝胆外科， 河北 唐山063000

据2020年全球癌症数据统计，肝癌是世界上第三大致死性癌症，占癌症死亡总数的8.3%，也是我国第二大致死性癌症，死亡率为13%[1]。肝癌患者早期无明显临床症状，就诊时多处于中晚期，失去了手术根治的机会；另一方面，术后患者复发率高[2]以及药物治疗效果不佳，致使肝癌的病死率居高不下。肝癌的主要病理类型为肝细胞癌(占75%～85%)[1]，因此，降低肝细胞癌患者的术后复发机会和提高药物疗效或开发新的分子靶点，成为了治疗肝细胞癌的迫切需要。本文对肝细胞癌发生发展过程中糖异生代谢关键酶的变化及其作用机制进行综述，并以此为依据分析这些关键酶是否可以成为肝细胞癌的治疗靶点。

1 肿瘤代谢中的糖酵解与糖异生

肿瘤细胞持续增殖的特性使其与正常细胞区分开来，早在1924年Warburg针对肿瘤的代谢研究发现，肿瘤细胞在有氧的环境下会利用葡萄糖而产生大量乳酸，这种现象称为Warburg效应或有氧糖酵解[3]。有氧糖酵解的某些中间代谢物可经由糖代谢分支途径合成核苷酸、蛋白质和脂质，例如葡萄糖-6-磷酸可合成5-磷酸核糖，3-磷酸甘油酸可合成丝氨酸或甘氨酸等等，从而可快速支持肿瘤细胞的生长和增殖；其次，有氧糖酵解代谢会导致肿瘤微环境中的葡萄糖缺乏和乳酸积累，从而造成免疫细胞内因葡萄糖缺乏而发生功能障碍，除此之外，还会间接诱导T淋巴细胞膜上的PD-1大量表达，肿瘤细胞的PD-L1与其结合后，抑制免疫细胞的抗肿瘤功能，而乳酸累积直接会导致肿瘤微环境中的透明质酸增加，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[3-7]。糖异生作为糖酵解的逆反应，可将非碳水化合物生糖氨基酸、乳酸和甘油等转化为葡萄糖或糖原，主要发生在肝脏和肾脏组织中[8]。其中有4个酶不与有氧糖酵解共用，分别是丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase, PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)、果糖-1,6-二磷酸酶1(fructose-1,6-bisphosphatase, FBP1)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6Pase)，同时也是糖异生代谢的关键限速酶。不同类型肿瘤中，糖异生关键限速酶与糖异生代谢并非完全同步。在肺癌[9-11]、乳腺癌[12-13]、结直肠癌[14]中，PC、PEPCK和G6Pase表达上调，而FBP1表达下调，提示糖异生代谢可能被关键限速酶截断后参与肿瘤的发生发展，也表明了肿瘤糖异生代谢的复杂性。而在肝细胞癌和肾癌这类糖异生组织中，PEPCK、FBP1和G6Pase表达均下调，糖异生代谢处于被抑制状态[4,14-15](图1)。因此，可从糖异生代谢的角度进一步了解肿瘤的代谢异质性。

2 糖异生在肿瘤发生、发展中的意义

糖异生代谢的中间代谢物和最终产生的葡萄糖均可促进肿瘤的有氧糖酵解，而其关键限速酶不仅在糖异生代谢中发挥作用，也有其他非糖异生功能或参与肿瘤发生发展的基因表达调控。在某些非糖异生肿瘤中，糖异生代谢的激活可增加对乳酸的利用以合成3-磷酸甘油酸，再经过丝氨酸合成途径生成丝氨酸和甘氨酸，参与嘌呤和嘧啶的合成；其次还可合成脂质，参与细胞膜的合成，从而促进肿瘤的增殖[3-5,14]。在糖异生肿瘤中如肝细胞癌，糖异生代谢被抑制，一是可促进有氧糖酵解，增加肝癌细胞的葡萄糖摄取量和乳酸生成量，从而促进肝细胞癌的生长、增殖[15-17]；二是可激活己糖胺生物合成途径，致使一些癌基因Rb、c-myc发生磷酸化而激活，从而促进肝细胞癌的增殖[18]；三是与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关，导致间质标志物表达上调，从而促进肝细胞癌的侵袭和转移[16]。

3 肝细胞癌中糖异生的改变及意义

3.1 PC与肝细胞癌 糖异生代谢的第一步，由PC介导，将进入线粒体的丙酮酸转变成草酰乙酸。早期的研究[19]发现，鼠和人肝细胞癌中PC的活性降低。在肝细胞癌大鼠模型中PC的mRNA和蛋白质水平下降，但在人肝细胞癌中PC的mRNA水平没有显著的变化[15,20]。而随后在GSE和TCGA数据库中研究[21]发现，人肝细胞癌的PC基因表达降低。因此，关于PC在人肝细胞癌中的表达水平变化还需进一步验证。

此外，有研究[20]表明PC表达降低可能与叉头盒转录因子O1(forkhead box O1, FOXO1)的活性降低相关。但Cheng等[22]研究表明lncRNA RP11-241J12.3可通过上调PC的表达减少丙酮酸的积累，不利于DNA修复从而促进肝细胞癌的侵袭。因此，关于肝细胞癌中PC表达水平研究结果的不一致，以及PC对肝细胞癌中丙酮酸代谢的影响值得进一步探究，以明确PC在肝细胞癌中是肿瘤抑制因子还是肿瘤促进因子，而后进一步寻找靶向PC的致癌信号通路，为肝细胞癌的分子靶向治疗提供理论基础。

3.2 PEPCK与肝细胞癌 PEPCK是糖异生代谢中的第二个关键限速酶，具有两种形式：细胞质型(PEPCK1)和线粒体型(PEPCK2)，可将草酰乙酸催化生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)[14,23]。与正常的肝组织相比，肝细胞癌中PEPCK1和PEPCK2的mRNA、蛋白质和酶活性均降低[24-25]，且PEPCK1的低表达与肝细胞癌患者的短生存期、高复发率以及不良预后显著相关[17]。

研究[14,17]发现，PEPCK1的低表达可促进HepG2肝癌细胞的增殖。而在肝细胞癌中恢复PEPCK1的表达，可导致促凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Caspase-3)的蛋白质水平增加，促进SK-Hep1和SMMC-7721肝癌细胞的凋亡；且肝癌细胞中糖异生代谢的中间代谢物PEP和3-磷酸甘油酸增多，磷酸戊糖途径的终产物5-磷酸核糖减少，三羧酸循坏中的柠檬酸、琥珀酸、苹果酸和ATP减少，呼吸链中的NADH/NAD+、CoQH2/CoQ和ROS水平升高以及GSH/GSSG下降，表明PEPCK1可能通过诱导糖异生、氧化应激和减少三羧酸循环中间体而导致能量危机和营养缺乏，促进肝细胞癌的死亡[17]。随后，Tuo等[26]进一步研究发现，PEPCK1低表达可通过抑制腺苷酸蛋白活化激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)/P27kip1轴，激活CDK2-Rb-E2F通路，使细胞分裂周期中的分裂间期G1期加速到S期，从而快速合成DNA，导致肝癌细胞的快速增殖；且在PEPCK1基因敲除的肝细胞癌小鼠模型中，AMPK激活剂二甲双胍可显著抑制PEPCK1基因敲除导致的肝细胞癌生长。同样，在SK-Hep1、Huh7和MHCC-97h肝癌细胞系中，PEPCK1低表达可通过抑制AMPK-GFAT1轴，激活己糖胺生物合成途径，使尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)生成增加；而O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)可将UDP-GlcNAc的GlcNAc连接到细胞周期检测点激酶2(cell-cycle checkpoint kinase 2, CHK2)的T378残基上，使CHK2蛋白发生O-GlcNA糖基化修饰，可阻止CHK2发生泛素化而降解，同时还可促进CHK2二聚化使其活化，进而导致CHK2的下游靶基因Rb磷酸化，促进肝细胞癌的增殖[27-29]，以上均表明了AMPK是PEPCK1低表达促进肝癌细胞生长的关键调节靶点。除此之外，蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)可使PCK1的Ser90发生磷酸化并使其向内质网转移，从而抑制PCK1与草酰乙酸结合，阻止肝癌细胞的糖异生；且进入内质网的磷酸化的PCK1会进一步与内质网上的胰岛素诱导基因(insulin inducible gene, INSIG)结合以及使其磷酸化，从而激活固醇调节元件结合蛋白(sterolregulatory element-binding protein, SREBP)和下游脂肪生成基因的转录，促进肝细胞癌的增殖，表明PCK1不仅影响肝癌细胞的糖异生代谢，也可通过其他分子影响肝癌细胞的脂代谢，从而影响肝细胞癌的生存[23]。总体来说，呈现低表达的PEPCK1更多的是与肝细胞癌的有氧糖酵解和细胞增殖的上调相关联，表明PEPCK1基因在肝细胞癌中起抑癌作用。因此，或许可以通过靶向PEPCK1恢复其表达以抑制肝细胞癌的增殖，从而达到治疗肝细胞癌的效果。

图1 肿瘤代谢中的糖酵解和糖异生Figure 1 Glycolysis and gluconeogenesis in tumor metabolism

目前有关PEPCK1在肝细胞癌中被下调的机制，一是FOXO1蛋白的核易位抑制PEPCK1基因的转录；二是蛋白质的翻译后机制导致PEPCK1蛋白自身降解(图2)。研究[30-31]发现在HepG2肝癌细胞中，P53和哺乳动物雷帕霉素受体复合物2(mammalian target of rapamycin complex 2, mTORC2)的高表达可导致FOXO1脱乙酰化和磷酸化，致使FOXO1不能进入细胞核中与PEPCK1启动子结合，从而使PEPCK1的mRNA表达降低。Shi等[32]研究也发现，在HepG2和Huh7细胞系中，乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白(hepatitis B X-interacting protein, HBXIP)一是通过增加靶向FOXO1 mRNA的3′-UTR区域的miRNA-135a，阻碍FOXO1基因的转录；二是通过激活PI3K/p-AKT信号通路，使p-FOXO1蛋白增加，导致FOXO1无法进行核易位，两种机制可导致PEPCK1的表达降低。因此，可以靶向FOXO1使其发生乙酰化和去磷酸化，升高PEPCK1在肝细胞癌中的表达，使糖酵解转向糖异生和降低三羧酸循环通量，致使肝细胞癌中的生物大分子缺乏而生长受限。此外，在HepG2肝癌细胞中，蛋白乙酰转移酶p300可以使PEPCK1和Ubc9乙酰化，乙酰化的PEPCK1与UBR5泛素连接酶和乙酰化的Ubc9相互作用，使PEPCK1泛素化和糖基化，导致PEPCK1蛋白发生降解[33]。而类固醇核激素受体转录因子Nur77可减弱依赖p300介导的乙酰化修饰以及竞争性抑制Ubc9与PEPCK1的结合，从而阻止PEPCK1的糖基化和降解，但由于Nur77在肝细胞癌中表达水平下降，这种阻碍效应被减弱，造成PEPCK1蛋白的加速降解[34-37]。且Nur77还可通过上调FBP1和G6PC基因的转录促进糖异生代谢[37]。因此，Nur77可作为提高PEPCK1在肝细胞癌中的表达的分子靶点，从而逆转肝细胞癌中的有氧糖酵解，抑制肝细胞癌的生长(图2)。

关于PEPCK的研究更多的是集中于PEPCK1，PEPCK2的研究非常少。但在对索拉非尼、乐伐替尼等酪氨酸激酶抑制剂耐药性的研究[38]中发现，由于PEPCK1的K473位点和PEPCK2的K491位点的乙酰化，可导致PEPCK1到PEPCK2的同工酶转变，致使PEPCK2表达增加，导致HepG2-R细胞的耐药性增加；并且在HepG2-R-siPCK2细胞异种移植的NCG小鼠模型中，与二甲基亚砜对照组相比，索拉非尼给药组的肝细胞癌的生长和瘤体的重量明显降低；同时在对术后进行索拉非尼治疗的肝癌患者分析中发现，PEPCK2高表达组的无进展生存期较短。因此，这些研究表明，降低PEPCK2的表达可以提高肝细胞癌对索拉非尼的敏感性。并且可在未来的研究中将靶向糖异生代谢的治疗药物与酪氨酸激酶抑制剂或其他药物联合应用，这将为延长肝细胞癌患者的生存期提供一个新的方向。

3.3 FBP1与肝细胞癌 果糖-1,6-二磷酸酶是糖异生途径的第三个限速酶，将果糖-1,6-二磷酸转变为果糖-6-磷酸，包括FBP1和FBP2两种亚型，FBP1存在于肝、肾组织中，FBP2只存在于肌肉组织中[39]。研究[21,40]发现在肝细胞癌中，FBP1基因的表达水平降低。且FBP1的低表达与肝细胞癌的大小、分期和恶性程度呈负相关，与术后短的总生存期和无复发生存期以及高的早期复发风险显著相关[21]。因此，可将FBP1作为肝细胞癌预后生存的潜在生物标志物以及预防术后复发的分子靶点。

Hirata等[21]研究发现，在HepG2和HuH7肝癌细胞系中过表达FBP1，肝癌细胞内葡萄糖的摄取、乳酸的分泌和糖酵解关键限速酶(己糖激酶2和磷酸果糖激酶1)显著减少，以及在GSE和TCGA数据库中FBP1表达越高，糖异生代谢越活跃，而有氧糖酵解活性降低，表明FBP1可促进糖异生而抑制肝细胞癌的有氧糖酵解[40]。此外，研究[41]还发现，FBP1基因删除导致小鼠肝脏的脂肪变性增加和游离脂肪酸水平增加，表明FBP1还干扰了脂肪代谢；且FBP1低表达可通过促进肝细胞释放高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1, HMGB1)触发肝星状细胞(HSC)的激活和衰老以及衰老相关的分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)的释放，从而促进肝细胞癌的进展。FBP1低表达通过诱导EMT促进肝癌细胞的转移[16,42]。总之，这些研究资料表明FBP1作为肝细胞癌的抑制因子，不仅抑制了肝细胞癌中的有氧糖酵解，而且还影响肝细胞癌的脂代谢以及将肝细胞与HSC联系起来，抑制肝细胞癌的发生发展。但是FBP1在其他致癌途径中的作用尚未可知，可进一步探索。

图2 PEPCK与肝细胞癌Figure 2 PEPCK and hepatocellular carcinoma

关于FBP1在肝细胞癌中的下调机制，一是FBP1基因启动子的甲基化、组蛋白翻译后修饰和miRNA等表观遗传方式抑制FBP1基因的转录；二是FBP1蛋白酶体的降解。研究[21]发现，FBP1启动子甲基化和拷贝数的减少，阻碍了FBP1基因的转录，导致FBP1 mRNA表达减少。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDAC)1/2可协同促进FBP1基因增强子上的H3K27Ac去乙酰化，导致HepG2和SK-Hep1肝癌细胞中FBP1的mRNA和蛋白质表达下降，且HDAC抑制剂NaBu、SAHA和LBH589呈剂量依赖性提高肝癌细胞中的FBP1的mRNA水平[43]。而组蛋白去甲基化酶(lysine specificdemetylase, LSD1)和组蛋白甲基转移酶zeste基因同源蛋白2(enhancer of zeste homolog, EZH2)可分别使FBP1基因启动子上的H3K4me2甲基化水平减少和H3K27me3甲基化水平增多，导致HepG2肝癌细胞的FBP1表达降低[44-46]。另外，肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor-4α, HNF-4α)与CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein α, C/EBPα)作为转录因子可与FBP1的启动子结合，抑制FBP1在HepG2和Huh7肝癌细胞中的表达[47]。热休克转录因子(heat shock transcription factor 2, HSF2)和常染色质组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 2, EHMT2)通过与FBP1启动子上的HSEs结合，导致Huh7和SMMC7721肝癌细胞中的FBP1 mRNA水平降低[48]。此外，黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene, MAGE)A3/C2可直接与三结构域蛋白(tripartite motifs, TRIM)28结合，形成MAGE-TRIM28-E3连接酶复合物，进而加强TRIM28的PHD和BROMO结构域与FBP1的E2结合，导致FBP1蛋白发生泛素化而降解，下调FBP1蛋白的表达，但不影响FBP1的mRNA水平[49]。除此之外，肢体和中枢神经系统表达1样蛋白(limb and CNS expressed 1 like, LIX1L)是一种RNA结合蛋白，可通过上调miRNA-21-3p的表达以及促进miRNA-21-3p与FBP1 mRNA的3′-UTR结合，阻止HepG2肝癌细胞中FBP1的转录，使FBP1的mRNA和蛋白质水平下降[16]。因此，可从启动子、组蛋白酶和miRNA水平上激活FBP1的表达，使肝细胞癌的有氧糖酵解流向糖异生，消耗糖酵解中间体，从而促使肝细胞癌的死亡(图3)。

3.4 G6Pase与肝细胞癌 在糖异生代谢的最后一步反应中，由G6Pase控制，在葡萄糖-6-磷酸化学物上去掉1个磷酸生成葡萄糖；G6Pase基因主要在肝脏和肾脏中表达。G6Pase有2个亚型，分别是G6PC和G6PT[14]。研究[15,31]发现，G6PC基因在肝细胞癌中的表达显著降低，且G6PC的低表达与肝细胞癌的分级相关，但与肝细胞癌的侵袭程度、分期和大小无关。

在肝癌细胞中，炎症因子IL-6使磷酸化的Stat3与G6PC和PEPCK1的启动子结合，导致染色质重塑，造成其转录受阻，从而引起PEPCK1和G6PC的mRNA表达下降；且IL-6-Stat3信号通路通过上调miRNA-23a，促进其与G6PC和过氧化物酶体增殖物受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1α, PGC1α)的mRNA结合，进一步抑制G6PC、PGC1α的表达和肝细胞癌的增殖[15]。G6PC降低可使肝癌细胞中的葡萄糖-6-磷酸积累，通过磷酸戊糖途径消耗生成核糖-5-磷酸，为肝癌细胞的增殖提供原料[50]。miRNA-23c也可直接靶向编码G6PC mRNA的3′-UTR，抑制G6PC的表达[51]。此外，LSD1使G6PC基因启动子上的H3K4me2甲基化，导致G6PC表达降低[44]。而在正常的肝细胞中，PGC1α可与FOXO1、HNF-4α相互作用以及激活cAMP-PKA-CREB信号通路，刺激PEPCK1和G6PC的表达[52]。但PGC1α在肝细胞癌中表达显著下调[14]。因此，猜测这种相互作用和激活通路的效果可能被减弱，导致PEPCK1和G6PC在肝细胞癌中的表达水平下降。研究[53-54]还发现，地塞米松呈剂量依赖性地通过恢复异种移植肝癌小鼠中PEPCK和G6Pase的蛋白水平，从而缩小肝癌小鼠中的瘤体大小和减弱瘤体中的血管生成。这些实验表明，G6PC在肝细胞癌中同样发挥的是抗癌作用，可与PEPCK和FBP1共同作用调控肝细胞癌的发生发展。

图3 FBP1与肝细胞癌Figure 3 FBP1 and hepatocellular carcinoma

4 小结与展望

综上所述，糖异生代谢及其4个关键限速酶在肝细胞癌中被下调，适应肿瘤的代谢。其中针对糖异生代谢的主要4个关键限速酶是某些致癌信号通路的下游靶点，通过扰乱有氧糖酵解代谢、戊糖磷酸途径、己糖胺生物合成、丝氨酸代谢和脂肪酸代谢在肝细胞癌的核苷酸、蛋白质和脂肪合成中发挥作用。因此，通过干预肝细胞癌的糖异生代谢及其关键限速酶的表达，去阻碍癌细胞三大营养物质的代谢以及促进免疫细胞功能的恢复发挥抗肿瘤功能。且对糖异生代谢中关键限速酶的靶向基因和所调控的信号转导通路的深入研究，将有助于开发新的肝细胞癌治疗药物。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：罗赛芳负责资料分析，撰写论文；马向明参与修改论文；曹立瀛负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。