基于“药辅合一”制备归桂自微乳载药系统Δ

李燕，王滨，王慧凯，高新富，宫凯凯，高俊玲，丁长玲（.滨州医学院附属医院药学部，山东 滨州 5660；.滨州市中医院康复科，山东 滨州 5660；.滨州医学院附属医院医学研究中心，山东 滨州 5660；4.滨州医学院附属医院国家药物临床试验机构，山东 滨州 5660）

当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，桂枝为樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl的干燥嫩枝。当归行气养血，与桂枝温阳化气相须为用，可除寒湿、止痹痛[1]。痹证是由风、寒、湿侵袭机体而致脉络闭阻，久之滞于血脉经络，从而引起的以肢体关节及肌肉酸痛、麻木、屈伸不利等为主症的一类病症，其治疗以温补气血为主，核心用药包括桂枝、当归、炙甘草等药材[2-3]。有学者通过分析古今医案中桂枝类方剂的配伍规律发现，该类方剂治疗关节疼痛的核心药对包括桂枝-当归、桂枝-附子、桂枝-甘草[1]。

当归、桂枝的主要药效物质为挥发油[4-5]。挥发油在常温下不稳定，且易在制剂过程中损失，而开发成适宜剂型则可有助于提高挥发油的稳定性[6]。自微乳载药系统（self-microemulsion drug delivery system，SMEDDS）由油相、乳化剂和助乳化剂以适宜比例混匀后自发形成，具热力学稳定、黏度低、高速离心、无相分离等特点，可增大挥发油的溶解度，提高其稳定性[7]。

“药辅合一”即“药之为辅”，指部分中药可通过利用其形、色、气、味等理化特性和助悬、分散、吸附、助磨、增稠等功能特性来作为辅料以辅助制剂的成型与稳定[8]。本课题组前期研究发现，当归、桂枝饮片等量混匀后提取的挥发油（以下简称“归桂混合挥发油”）可作为SMEDDS的油相。基于此，本研究拟将归桂混合挥发油同时作为油相和模型药物，制备归桂自微乳载药系统（Angelica-CinnamomumSMEDDS，AC-SMEDDS），优化其处方并表征所得制剂，为研发相关新剂型和扩大中药挥发油应用途径提供思路。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有LC-20AT型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）、HT7700型透射电镜（日立Hitachi公司）、Matersizer 3000型激光粒度分析仪（英国Malvern有限公司）等。

1.2 主要药品与试剂

当归饮片（批号20210310）、桂枝饮片（批号20210123）均购自亳州市甄药源中药科技有限公司，经滨州市中医院妇产科王君教授鉴定分别为伞形科植物当归A.sinensis（Oliv.）Diels的干燥根和樟科植物肉桂C.cassiaPresl的干燥嫩枝。

藁本内酯对照品（批号B20492，纯度≥98%）、桂皮醛对照品（批号B21481，纯度≥98%）均购自上海源叶生物科技有限公司；蓖麻油聚氧乙烯（40）醚（EL-40，批号090000001100）购自临沂绿森化工有限公司；氢化蓖麻油聚氧乙烯（40）醚（CO-40，批号089618007420）、聚乙二醇400（PEG400，批号089790003160）均购自山东优索化工科技有限公司；聚氧乙烯40氢化蓖麻油（RH-40，批号100589021004）购自江苏省海安市石油化工厂；丙二醇（PG，批号100420190303）、聚山梨酯80（TW-80，批号101720191103）均购自湖南尔康制药股份有限公司；乙醇（批号20200929）购自国药集团化学试剂有限公司；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 归桂混合挥发油和当归、桂枝挥发油的制备

将当归、桂枝饮片粉碎，取粗粉等量混匀，加10倍量水，浸泡100 min，以水蒸气蒸馏法提取5 h[9]，即得归桂混合挥发油（得率为0.417%）。同法制得当归挥发油、桂枝挥发油（得率分别为0.381%、0.472%）。

2.2 AC-SMEDDS、当归挥发油-SMEDDS、桂枝挥发油-SMEDDS的制备

取处方量的归桂混合挥发油，置于含混合乳化剂（乳化剂和助乳化剂以一定质量比混合）的具塞西林瓶中，以400 r/min搅拌至形成均匀、澄清且流动性好的淡黄色溶液，即得AC-SMEDDS。取处方量的当归挥发油或桂枝挥发油，同法处理，即得当归挥发油-SMEDDS、桂枝挥发油-SMEDDS。

2.3 藁本内酯的含量测定

2.3.1 色谱条件 色谱条件参考文献[10]：以Waters Symmetry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈-水（63∶37，V/V）为流动相；柱温为25 ℃；流速为1 mL/min；检测波长为326 nm；进样量为10 μL。

2.3.2 溶液的制备 （1）取藁本内酯对照品20 mg，用乙腈溶解并定容于2 mL量瓶中，制得藁本内酯质量浓度为10 mg/mL的对照品储备液。（2）取“2.2”项下AC-SMEDDS（乳化剂为EL-40，助乳化剂为乙醇，两者质量比为9∶1）适量，以10 000 r/min离心5 min，取上清液0.1 g，加乙腈定容于10 mL量瓶中，即得供试品溶液。（3）取“2.2”项下桂枝挥发油-SMEDDS适量，按“2.3.2（2）”项下方法制备阴性溶液。

2.3.3 方法学考察 参照2020年版《中国药典》（四部）相关要求进行专属性、线性关系考察和精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验[9]。结果显示，供试品中藁本内酯色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，且阴性溶液对测定无干扰（图略）；藁本内酯的回归方程为y＝18 283.01x-329 124.40（R2＝0.999 7），其检测质量浓度的线性范围为25～125 μg/mL；精密度、稳定性（12 h）、重复性、加样回收率试验的RSD均小于2%。

2.4 桂皮醛的含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱条件参考文献[11]：以Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸溶液（34∶66，V/V）为流动相；柱温为25℃；流速为1 mL/min；检测波长为290 nm；进样量为10 μL。

2.4.2 溶液的制备 （1）取桂皮醛对照品20 mg，用乙腈溶解并定容于2 mL量瓶中，制得桂皮醛质量浓度为10 mg/mL的对照品储备液。（2）供试品溶液的配制同“2.3.2（2）”项。（3）取当归挥发油-SMEDDS适量，按“2.3.2（3）”项下方法制备阴性溶液。

2.4.3 方法学考察 参照2020年版《中国药典》（四部）相关要求进行专属性、线性关系考察和精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验[9]。结果显示，供试品中桂皮醛色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，且阴性溶液对测定无干扰（图略）；桂皮醛的回归方程为y＝61 936.90x+906 046.75（R2＝0.999 8），其检测质量浓度的线性范围为20～140 μg/mL；精密度、稳定性（8 h）、重复性、加样回收率试验的RSD均小于2%。

2.5 乳化剂和助乳化剂的筛选

2.5.1 乳化剂和助乳化剂的初筛 取“2.1”项下归桂混合挥发油0.5 g，与不同乳化剂（EL-40、TW-80、CO-40、RH-40）或助乳化剂（乙醇、PEG400、PG）1 g混合，分别置于具塞西林瓶中，涡旋混匀24 h，以10 000 r/min离心5 min，取上清液0.1 mL，用乙腈定容于10 mL量瓶中，即得归桂混合挥发油溶于不同辅料的样品溶液。取上述样品溶液，分别按“2.3”“2.4”项下方法测定藁本内酯、桂皮醛的含量并按下式计算两者溶解度：溶解度＝藁本内酯或桂皮醛的质量（mg）/溶剂体积（mL）。取溶解度大者为目标辅料，每份样品重复3次。结果（表1）显示，藁本内酯在各辅料中的溶解度依次为乙醇＞PEG400＞EL-40＞TW-80＞CO-40＞PG＞RH-40，桂皮醛在各辅料中的溶解度依次为EL-40＞TW-80＞乙醇＞RH-40＞PEG400＞CO-40＞PG，故初步确定EL-40、TW-80为待选乳化剂，乙醇、PEG400为待选助乳化剂。

表1 归桂混合挥发油在不同辅料中的溶解度（±s，n＝3）

表1 归桂混合挥发油在不同辅料中的溶解度（±s，n＝3）

辅料EL-40 TW-80 RH-40 CO-40乙醇PEG400 PG藁本内酯/（mg/mL）5.32±0.04 4.19±0.02 3.86±0.02 4.17±0.01 7.62±0.05 5.76±0.02 3.90±0.01桂皮醛/（mg/mL）2.14±0.02 1.77±0.01 1.47±0.01 0.78±0.01 1.65±0.02 1.32±0.01 0.75±0.01

2.5.2 乳化剂与助乳化剂质量比的筛选 固定归桂混合挥发油、混合乳化剂[乳化剂和助乳化剂的质量比分别为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5]的总质量为1 g，涡旋混匀，加水100 mL，考察归桂混合挥发油与混合乳化剂质量比为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5时各体系的分散情况，绘制归桂混合挥发油/EL-40/乙醇、归桂混合挥发油/EL-40/PEG400、归桂混合挥发油/TW-80/乙醇、归桂混合挥发油/TW-80/PEG400的伪三元相图（可形成自微乳的区域用黑色表示）。结果（图1）显示，当以EL-40为乳化剂、乙醇为助乳化剂时，自微乳区域面积最大。同时笔者在前期研究中发现，当乳化剂和助乳化剂的质量比为1∶9、2∶8、3∶7、4∶6时，只能形成白色的乳浊液体系；而当两者质量比为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5时，则可形成均一、透明的微乳液。因此，本研究确定EL-40为乳化剂、乙醇为助乳化剂，并结合前期预实验结果进一步将两者质量比的优化范围缩小为15∶2～9∶1。

图1 不同体系的伪三元相图

2.6 AC-SMEDDS处方的优化

结合前期研究和上述实验结果，本研究进一步以油相（即归桂混合挥发油）占比（A）、乳化剂与助乳化剂质量比（B）为因素，以平均粒径（Y1）、挥发油含量（即挥发油在AC-SMEDDS中的质量百分比，Y2）、乳化时间（Y3）为指标[12]，采用中心复合设计-效应面（central composite design-response surface methodology，CCD）法优化处方，具体因素与水平见表2。采用层次分析法构建判断矩阵并利用SPSSAU软件计算得Y1、Y2、Y3的权重系数分别为0.29、0.57、0.14，同时得最大特征根为3，一致性比例因子为0（＜0.01），提示权重系数赋值合理[13]。按下式对各指标进行归一化处理：平均粒径的归一值（Y11）＝（200-Y1）/200，挥发油含量的归一值（Y21）＝Y2/31，乳化时间的归一值（Y31）＝（30-Y3）/30（式中，各常数项为Y1～Y3实测最大值经取整后所得）；再按下式计算综合评分（Y）：Y＝Y11×0.29+Y21×0.57+Y31×0.14，Y越大表示处方组成越理想[14]。结果见表3。

表2 AC-SMEDDS处方优化的因素与水平

表3 AC-SMEDDS处方优化的实验设计与结果

使用Design-Expert 8.0.6软件回归拟合，得二元二次回归方程为Y＝0.610+0.005A+0.023B-0.001AB+0.026A2+0.007B2。同时，对其进行方差分析，结果（表4）显示，模型的P小于0.000 1，提示其拟合良好；失拟项的P为0.069 0，提示残差对优化结果的影响不明显；A、B、A2、B2均为显著项（P＜0.05），表明考察因素与指标之间并非简单的线性关系。此外，本模型的精密度良好（R2＝0.975 5）、变异系数较低（0.92%），可较好地反映因素A、B与综合评分之间的关系。

表4 方差分析结果

根据模型绘制效应面图和等高线图，考察两因素的交互作用。效应面图（图2A）显示，综合评分随乳化剂与助乳化剂质量比的增加呈非线性升高的趋势，且曲面较为平滑；随着油相占比的增加，综合评分先降低后升高；等高线图（图2B）显示，其曲线接近圆形，表明因素A、B之间的交互作用不明显。

图2 两因素交互作用的效应面图和等高线图

采用Design-Expert 8.0.6软件求解上述二元二次方程，得模型预测的最优处方为油相占比29.39%，乳化剂与助乳化剂质量比439∶50。考虑到工业生产实际，本研究最终确定最优处方为油相占比30%，乳化剂（EL-40）与助乳化剂（乙醇）质量比9∶1。按此条件平行制备3批AC-SMEDDS，测得平均挥发油含量为30%，平均粒径为（148.33±1.53）nm，乳化时间为（18.44±0.11）s；3批样品的综合评分为0.68，与预测值（0.70）的相对误差为2.86%，提示该处方可行。

2.7 AC-SMEDDS的质量评价

2.7.1 外观和微观形态观察 按“2.6”项下最优处方制备AC-SMEDDS，观察其外观和微观形态。结果显示，AC-SMEDD为淡黄色液体，略黏稠，均匀、澄清且流动性好（图3A）；加水稀释后，所得微乳液呈半透明状，均匀，带淡蓝色乳光（图3B）；将上述微乳液滴于碳膜铜网上，用2%磷钨酸溶液复染，置于透射电镜下观察，可见其微粒呈边缘半透明的球形，无粘连（图3C）。

图3 AC-SMEDDS的外观和微观形态

2.7.2 载药量和包封率的测定 取按最优处方所制的AC-SMEDDS 0.1 g，用乙腈定容于2 mL量瓶中，按“2.3”“2.4”项下方法测定其中藁本内酯、桂皮醛的含量并计算载药量：载药量＝制剂所含藁本内酯（或桂皮醛）的质量（mg）/制剂总质量（g）[9]。另取上述AC-SMEDDS 0.1 g，用水定容于2 mL量瓶中，以10 000 r/min离心5 min，取上清液0.4 mL，用乙腈定容于2 mL量瓶中，按“2.3”“2.4”项下方法测定其中藁本内酯、桂皮醛的含量并计算包封率：包封率＝微乳制剂包封的藁本内酯（或桂皮醛）的质量/微乳制剂中包封与未包封藁本内酯（或桂皮醛）的总量×100%[9]。样品重复测定3次。结果显示，分别以藁本内酯、桂皮醛计，AC-SMEDDS的载药量为（7.58±0.03）、（4.17±0.01）mg/g，包封率为（93.25±0.01）%、（88.89±0.02）%。

2.7.3 稀释倍数对粒径的影响 取按最优处方所制的AC-SMEDDS 0.1 g，分别加水稀释50、100、200倍，涡旋混匀，用激光粒度分析仪测定粒径，重复3次。结果显示，各稀释样品的粒径均稳定于（149.01±1.03）nm。

2.7.4 稳定性考察 （1）离心稳定性考察：取按最优处方所制的AC-SMEDDS 0.1 g，加适量水，以10 000 r/min离心5 min。此过程中，未见沉淀或油滴析出。（2）初步稳定性考察：取按最优处方所制的AC-SMEDDS适量，分别于4、25 ℃密封保存，再于第0、1、3、5、7天时以10 000 r/min离心5 min，观察外观性状并按“2.3”“2.4”项下方法测定其中藁本内酯、桂皮醛含量。每样品重复测定3次。结果显示，在4或25℃下放置7 d内，各样品均为均匀、澄清的淡黄色液体，离心未见沉淀或油滴析出；藁本内酯、桂皮醛含量分别为（7.58±0.91）、（4.17±1.14）mg/g。

3 讨论

藁本内酯、桂皮醛为当归、桂枝挥发油发挥抗菌消炎作用的主要药效成分[4-5]，将两者作为AC-SMEDDS的指标性成分可全面反映制剂的质量。考虑到两者均为热不稳定成分，为验证水蒸气蒸馏法提取的可行性，本研究前期按“2.1”项下方法平行提取归桂混合挥发油3次，测得提取率的RSD为0.88%，藁本内酯、桂皮醛含量的RSD分别为0.71%、0.56%，提示水蒸气蒸馏法稳定、可行。

选择适宜的辅料是成功制备SMEDDS的关键。药用微乳所用辅料要求毒性低、乳化效果好，且亲水亲油平衡值高的乳化剂可促进微乳的形成[15]。本课题组前期在预实验中分别考察了归桂混合挥发油与等量RH-40、EL-40、TW-80、CO-40、乙醇、PEG400、PG、甘油混合后的体系状态，结果显示，归桂混合挥发油在甘油中的溶解度最低，故将该辅料剔除。

在此基础上，本研究以归桂混合挥发油为油相和模型药物，基于“药辅合一”理念制备了AC-SMEDDS，并对其处方进行了优化：首先，通过测定溶解度和绘制伪三元相图筛选出乳化剂（EL-40）和助乳化剂（乙醇），并得出两者质量比的优化范围为15∶2～9∶1。其次，以油相占比、乳化剂与助乳化剂质量比为因素，以SMEDDS稳定性评价重要指标（挥发油含量、粒径、乳化时间）的综合评分为指标，采用CCD法优化得其最优处方为油相占比30%、乳化剂与助乳化剂质量比9∶1。最后，对按最优处方所制AC-SMEDDS的质量进行初步评价，结果显示，以藁本内酯、桂皮醛计，其载药量分别为（7.58±0.03）、（4.17±0.01）mg/g，包封率为（93.25±0.01）%、（88.89±0.02）%，且样品稳定性良好。但由于时间有限，所制AC-SMEDDS的加速试验和长期稳定性试验有待于后续完善。

综上所述，本研究成功制备了AC-SMEDDS并优化了其处方，所得制剂的稳定性良好。