利用近红外反射光谱检测豆粕中掺假棉籽粕的研究

邓凯东, 潘文静, 陆牡龙, 边高瑞, 唐 倩, 陈玉华, 何晓芳

（金陵科技学院动物科学与食品工程学院, 江苏南京 210038）

豆粕作为饲粮中蛋白质的主要来源, 是畜禽养殖中应用最普遍的植物性蛋白质饲料, 因供求关系不平衡, 一些不法商贩在利益驱使下, 会在豆粕中掺入其他成分, 以次充好、以假乱真, 扰乱饲料市场秩序, 危害畜禽养殖生产, 造成饲料安全和食品安全隐患。饲料掺假检测多采用显微镜检、化学分析等方法（阴正兴等, 2008）, 但前者只能定性而不能定量分析, 后者测定繁琐、费时费力、对操作人员和实验条件要求较高、存在化学试剂污染环境的风险等。近红外光谱分析是近几十年发展起来的一种新兴技术, 具有分析速度快、样品适用范围广、样品无需前处理、无需化学试剂、无环境污染、操作相对简便等优点。近红外光是指波长介于780～2526 nm的电磁波, 照射物质后会发生吸收、透射、散射和反射, 可反映物质分子中含氢基团（C—H、O—H、N—H、S—H等）的种类和数量, 因此, 近红外反射（near-infrared reflectance；NIR）光谱适合于各种有机物的定性和定量分析, 已在畜禽饲料原料品质检测和质量安全控制中广泛应用（徐淼等, 2019；李玉鹏等, 2017；刘帅等, 2016）, 在食品掺假（Şen等, 2021；姚婉清等, 2020；张晶等, 2018；莫欣欣等, 2016；Cattaneo和Holroyd, 2013）和 饲 料 掺假（Rodionova等, 2021；孙丹丹等, 2015；孙丹丹等, 2014；Haughey等, 2013；石光涛等, 2009）的定性鉴别和定量分析中亦具有高度准确性。豆粕中掺杂棉籽粕的NIR光谱分析方法尚未见报道。本实验拟研究豆粕中掺杂棉籽粕的NIR特征光谱, 通过化学计量学方法建立、优化和评价棉籽粕掺假率的NIR预测模型, 为豆粕掺假定量检测提供新途径和新方法。

1 材料与方法

1.1 样品制备 豆粕和棉籽粕样品采自江苏某饲料厂, 用高速旋风式粉碎机（FS-ll, 浙江托普云农科技股份有限公司）粉碎, 使之全部通过1 mm筛, 再用精密天平（准确至0.001 g）称取豆粕和棉籽粕, 按质量百分比在豆粕中分别掺入0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%棉籽粕, 每个掺假水平各制备样品30个, 随机选取20个样品作为建模集、10个作为验证集, 各掺假样品充分混合均匀后, 密封保存于塑料样品袋中备用。

1.2 NIR光谱模型建立 通过傅里叶变换近红外光谱仪（Tensor II, Bruker公司, 德国）获取样品的NIR光谱, 附件选用漫反射积分球（IntegratIR, PIKE Technologies, Inc.）, 扫 描光谱波数范围为10000～4000 cm-1（波长1000～2500 nm）, 以空白背景作为参比。样品装填至扫描石英管容积2/3处, 每个样品平行扫描采集光谱3次。实验环境温度为22℃, 近红外光源预热1 h后, 按照仪器操作规程检测近红外光源信号干涉峰强度和幅度正常后开始采集样品NIR光谱。

样品NIR光谱由仪器自带的化学计量学软件OPUS（版本7.5；Bruker公司, 德国）自动获取和处理。建模集样品共采集了420个NIR光谱数据, 其中14个被OPUS软件判别为异常值而被剔除, 其余406个数据用于建模。建模集样品的NIR光谱通过OPUS软件自动拟合预测模型, 包括采用矢量归一化（SNV）、多元散射校正（MSC）、减去一条直线、最小—最大归一化、消除常数偏移量、线性补偿差减法等方法对原始光谱进行预处理, 保证光谱数据和含量数据间良好的相关性, 再通过偏最小二乘法（PLS）拟合豆粕中棉籽粕掺假率的NIR光谱预测模型, 最后再经过优化和检验, 根据交叉验证均方根误差（RMSECV；代表预测模型误差）, 并结合决定系数（R2）和斜率, 确定最优预测模型：RMSECV越接近0、R2和斜率越接近1, 预测模型越准确。

1.3 NIR光谱模型验证 每个掺假水平的10个验证集样品（共计60个）采用与上述相同的方法获取NIR光谱, 带入上述拟合的NIR预测模型中, 计算棉籽粕掺假率的预测值, 再与掺假率真值比较, 拟合预测值与真值回归方程, 并计算预测值的绝对误差和相对误差, 用于验证NIR预测模型的准确性。

2 结果与分析

2.1 NIR预测模型评价 纯豆粕和掺杂5%～30%棉籽粕的豆粕NIR光谱见图1。经OPUS软件判别, 掺杂棉籽粕的豆粕NIR特征光谱范围为6102.3～4247.6 cm-1, 约为近红外光谱的最后1/3范围, 即棉籽粕掺假比例不同的豆粕NIR光谱在上述光谱范围存在明显差异；在其他谱区, 则无差异。表1为利用OPUS软件在不同维数下拟合的建模集豆粕中棉籽粕掺假率的NIR光谱预测模型评价参数。OPUS软件根据R2、RMSECV、斜率和预测偏差等参数选择最佳维数, 确定最优预测模型。豆粕掺假棉籽粕的NIR光谱预测模型的推荐维数是5, 最优预测模型的R2为0.975、RMSECV为1.58, 斜率为0.974（图2）。

图1 纯豆粕（上）和掺杂不同比例棉籽粕的豆粕（下）NIR光谱

图2 建模集豆粕中棉籽粕掺假率的NIR模型预测值和真值关系

表1 不同维数下建模集豆粕中棉籽粕掺假率的NIR光谱预测模型评价参数

2.2 NIR预测模型验证 验证集豆粕中棉籽粕掺假率的NIR光谱模型预测值和真值回归关系见图3。验证集豆粕中棉籽粕掺假率预测值和真实值回归方程R2为0.960。随着豆粕中棉籽粕掺假比例由5%逐步增加至30%, NIR光谱模型预测值的相对误差则由15.0%降低至0.87%（表2）。

图3 验证集豆粕中棉籽粕掺假率的NIR光谱模型预测值和真值关系

表2 验证集豆粕中棉籽粕掺假率的NIR光谱模型预测值验证

3 讨论

化学计量学软件OPUS鉴别出豆粕中棉籽粕不同掺假含量的NIR特征光谱范围为6102.3～4247.6 cm-1, 说明掺入不同水平棉籽粕的豆粕NIR光谱在特定范围内出现差异, 也证实了以NIR光谱分析技术对棉籽粕掺假量进行定量预测是可行的, 为定量分析棉籽粕掺假量提供了建模依据。Haughey等（2013）研究发现, 豆粕中掺入0.1%～2.0%三聚氰胺的NIR特征光谱范围为9000～4000 cm-1。孙丹丹等（2014）则报道, 豆粕中掺入3%三聚氰胺或尿素后, NIR特征光谱分别出现在5066 cm-1和6812 cm-1附近, 反映了两种掺假物中含H集团氨基（-NH2）的变化。豆粕中掺入5.00%尿素聚合物的NIR特征光谱范围为7567～3695 cm-1区间, 反映了尿素聚合物中氨基（-NH2）和羟基（-OH）的变化（孙丹丹等, 2015）。此外, 鱼粉中掺入0.1%～15.0%三聚氰胺的NIR特征光谱范围包括7560.0～7058.5、6915.8～6098.1和4601.6～4246.7 cm-1三 段（刘小莉等, 2010）。石光涛等（2009）发现, 鱼粉中掺杂2%～50%豆粕的NIR特征光谱范围为5882.4～5555.6 cm-1。鱼粉中掺入1%～33%肉骨粉后, NIR光谱在5882.4 cm-1附近出现显著差异, 这主要是由于鱼粉和肉骨粉的蛋白质和饱和脂肪酸含量差异所致（杨增玲等, 2009）。

豆粕中掺假棉籽粕含量的NIR光谱最优预测模型的决定系数达到0.975（表1和图2）, 表明NIR光谱预测模型的拟合性好, 预测准确性高, 可以准确定量预测豆粕中掺杂的棉籽粕含量。利用NIR光谱可以准确检验豆粕中掺入的三聚氰胺, 在去皮豆粕或烘烤豆粕中掺入0.1%～2.0%三聚氰胺的NIR光谱预测模型的R2介于0.89～0.99, RMSECV为0.081～0.276（Haughey等, 2013）。鱼粉中掺杂0.1%～15.0%三聚氰胺的NIR光谱定量分析最优模型的R2则为0.948（刘小莉等, 2010）。此外, 定量分析鱼粉中掺假肉骨粉含量的NIR光谱预测模型R2分别达到了0.90（湛小梅等, 2009）、0.94（Murray等, 2001）和0.95（杨 增 玲等, 2009）。石光涛等（2009）拟合了鱼粉中掺杂2%～50%豆粕的NIR光谱定量预测模型, 发现最优预测模型的R2为0.989。本实验所拟合的豆粕中棉籽粕掺假量的NIR光谱预测模型的R2数值上高于上述报道的鱼粉中掺假物含量的NIRS预测模型（刘小莉等, 2010；杨增玲等, 2009；湛小梅等, 2009；Murray等, 2001）, 这可能与实验材料、样本含量、光谱仪器、建模软件和建模方法等因素不同有关。此外, 综合文献结果和本实验结果可以看出, 饲料中各种掺假物含量的NIR光谱预测模型R2普遍≥0.90, 说明NIR光谱模型的拟合性好, 可以准确定量分析饲料中掺假物含量。

本研究将拟合的NIR定标模型对验证集样本的棉籽粕含量进行预测, 以检验NIR光谱定量分析模型的预测准确度和可靠性。结果表明, 验证集的棉籽粕掺假率预测值和真实值间回归方程的R2为0.960, 说明预测模型的准确性较高（图3）。姚婉清等（2020）报道, 通过NIR光谱模型预测的山茶油中玉米油和花生油掺假比例与掺假真值无显著差异, 预测值相对误差＜6%。NIR光谱技术还可以准确区分甜荞粉、苦荞粉、小麦粉和燕麦粉, 在苦荞粉中掺入10%、25%和50%小麦粉后, 通过NIR光谱模型预测的小麦粉含量的相对误差为4.6%（张晶等, 2018）。孙丹丹等（2014）利用NIR光谱技术对豆粕中掺入0.1%～5.0%三聚氰胺或尿素进行判别, 拟合的NIR光谱预测模型对掺入三聚氰胺样品的验证集判别准确率＞95.3%, 掺入尿素样品的验证集判别准确率＞94.2%。利用NIR光谱技术对豆粕中掺入0.08%～5.00%尿素聚合物进行判别, 拟合的NIR光谱预测模型对掺入尿素聚合物样品的最低检测含量为1.00%, 判别准确率＞99.0%（孙丹丹等, 2015）。

本实验的NIR光谱预测模型验证结果表明, 随着豆粕中棉籽粕掺假率由5%增加至30%, NIR光谱定量分析模型预测值的相对误差呈逐步降低趋势, 由15.0%降至0.87%（表2）。当棉籽粕掺假率≥10%时, NIR光谱定量分析模型预测值的相对误差＜2%, 说明豆粕中棉籽粕掺假比例=5%时, 预测模型的准确度有待提高；掺假比例为10%～30%, 预测模型的准确性很高。杨增玲等（2009）拟合了鱼粉中掺入1%～33%肉骨粉的NIR光谱预测模型（R2=0.95）, 对验证集鱼粉中肉骨粉含量的总体正确判断率为95.6%；当肉骨粉掺入量≥5%时, 正确判断率提高至100%。刘小莉等（2010）拟合了鱼粉中掺杂0.1%～15.0%三聚氰胺的NIR光谱定量分析模型发现, 模型对三聚氰胺掺杂量居中者的预测误差均低于掺杂量偏低和偏高者, 且针对0.1%～5.5%三聚氰胺模型的预测误差亦低于0.1%～15.0%三聚氰胺模型, 由此推断, 将较宽建模浓度范围划分为若干小范围分别建立模型, 可能有利于提高NIR光谱模型的拟合能力和预测准确度。今后尚需研究改善豆粕中低水平棉籽粕掺假率（～5%）的NIR光谱预测模型拟合度和准确性的措施, 并确定利用NIR光谱技术定量检测豆粕中掺假棉籽粕含量的最低检测限。

4 结论

豆粕中掺假棉籽粕含量的NIR光谱预测模型R2为0.975, RMSECV为1.58, 表明NIR光谱定量分析模型拟合性好, 预测准确性高。验证集豆粕中棉籽粕掺假比例的NIR光谱模型预测值与真值的回归方程R2为0.960, 棉籽粕掺假比例为10%～30%时, NIR光谱模型预测值的相对误差为0.87%～1.87%。因此, NIR光谱预测模型可以准确定量分析豆粕中棉籽粕掺假量, 为豆粕中掺假物鉴别提供了一种准确、可靠的定量方法。