改性凹凸棒黏土/羧甲基壳聚糖协同稳定桉叶精油Pickering乳液制备及缓释抑菌性能

史沛青，郑艳茹，陈 晖,2，王轩栋，韩明明，施小宁,3,*

（1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学理化实验中心，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省中医药研究中心，甘肃 兰州 730000）

桉叶精油是桃金娘科（Myrtaceae）桉属（Eucalyptus）桉树叶的油腺细胞分泌物，主要成分为萜烯类和醇类化合物，有广谱抑菌性和抗氧化性，已被广泛应用于食品、化妆品、香料和制药领域。桉叶精油对人畜安全，低浓度可杀死食品中的微生物，开发桉叶精油抑菌剂备受关注。但桉叶精油易挥发，易氧化，稳定性差，功效持续时间短，不耐储藏保存，限制了其在食品、药品、化妆品等领域的应用。提高精油稳定性常用的方法有脂质化技术、环糊精包合技术、微囊化技术和微乳化技术，其中微乳化技术由于操作简便而被广泛应用。

Pickering乳液是一种以固体粒子替代传统表面活性剂稳定乳液体系的新型乳液。相比传统乳剂，其具有高抗聚结稳定性、低毒性和可生物相容性等特点，对改善植物精油的稳定性具有良好的应用优势。Pickering乳液制备使用的固体粒子按来源有天然粒子（如植物蛋白、天然多糖和黏土矿物等）和合成粒子（如石墨烯、SiO、TiO

等）。由于天然粒子较合成粒子更绿色无毒、价格低廉，在食品级Pickering乳液制备方面应用更广。羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）作为壳聚糖的两性衍生物，可水溶，有良好抑菌活性、生物相容性和生物降解性，使其更适用于生物活性物质递送系统。但是由于CMCS的强亲水特性，使其无法单独作为稳定剂制备Pickering乳液。Xie Bing等以CMCS与纳米微纤丝为稳定剂，制备了可食性的蜂蜡水基Pickering乳液，可用于水果和蔬菜保鲜。

凹凸棒黏土（attapulgite，APT）是一种天然层链状含水富镁铝硅酸盐黏土矿物，具有独特的纳米棒状形貌，外表面凹凸相间，比表面积大，有良好的吸附性与抑菌性能，是医药工业中优良的药用辅料，可直接稳定或改性稳定Pickering乳液。APT在稳定Pickering乳液方面，主要取决于其棒晶结构、负电性以及表面的活性基团特性。为使APT纳米粒子实现对桉叶精油滴的吸附包封，本研究通过油酸钠物理吸附对APT表面润湿性适当改性，与CMCS链自组装协同稳定制备桉叶精油Pickering乳液，通过乳液静置乳析和乳滴显微形貌考察影响乳液稳定性的各因素，获得最佳制备条件，并对比考察桉叶精油和其乳液对革兰氏阳性菌的抑制活性和缓释抑菌性能，为该乳剂在食品、药品、化妆品等领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桉叶精油 江西恒诚天然香料油有限公司；CMCS和尼罗红（纯度≥95.0%） 上海麦克林生化科技有限公司；APT 江苏鼎邦矿产品科技有限公司；油酸钠（化学纯） 上海试剂一厂；LB琼脂 上海博微生物科技有限公司；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌及黄曲霉菌 上海保藏生物技术中心。

1.2 仪器与设备

HR-6B型高速剪切乳化机 上海沪析实业有限公司；SB25-12DTD型超声波清洗仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；HY-4型调速多用振荡器 江苏荣华仪器制造有限公司；UV8100A型紫外-可见分光光度计北京莱伯泰科仪器股份有限公司；JL-1198型纳米激光粒度仪 成都精新粉体测试设备有限公司；Gemini HR型流变仪 英国马尔文仪器有限公司；BX53型生物显微镜 日本Olympus公司；SPX-400L型生化培养箱上海龙跃仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油酸钠改性APT（M-APT）纳米粒子制备及结构表征

将1.00 g APT按固液质量比1∶20用电动搅拌机在800 r/min下均匀分散于蒸馏水中，用0.1 mol/L HCl溶液调节悬浮液pH 4，然后置于60 ℃水浴中，加入2.0%油酸钠（按APT加入量计算），超声作用1 h，过滤，固体物用50 ℃蒸馏水充分洗涤，洗去表面可洗脱的油酸钠后冷冻干燥，备用。

傅里叶红外光谱分析：采用KBr压片法，在4 000～400 cm波长范围内扫描，设置分辨率为2 cm。

粒径测定：以蒸馏水为分散介质，使用纳米激光粒度仪对油酸钠改性前后APT的粒径进行测定，分散介质折射率1.330，测试温度25 ℃。

三相接触角θ测定：用压片机将APT样品压成13 mm×2 mm的圆柱形片剂，在样品表面滴2 μL蒸馏水，平衡10 s后，用像片量角法测定其θ值。

1.3.2 M-APT/CMCS协同稳定桉叶精油Pickering乳液制备

称取一定量CMCS，用去离子水配成质量分数分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的溶液，调节pH值为6.0，完全排除其中气泡，备用；称取一定量M-APT，超声分散制备质量分数分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.30%的悬浮液，备用。

量取一定体积的桉叶精油，加入5 mL一定质量分数的M-APT悬浮液，用高速剪切乳化机10 000 r/min分散1 min，静置30 min，使M-APT纳米粒子充分在油滴表面吸附平衡后再加入5 mL一定质量分数的CMCS溶液，同样高速剪切分散1 min，即得M-APT/CMCS协同稳定的桉叶精油Pickering乳液。

尼罗红油相标记的乳液制备方法与上述相同，需提前在桉叶精油中加入0.1 mL 1%的尼罗红溶液。

1.3.3 M-APT/CMCS协同稳定桉叶精油Pickering乳液表征

将1.3.2节所制乳液倒入沉降瓶中（约10 mL），拍照记录其在不同静置时间（1、5、10、15、30 d）的外观分层和表面油析状况；乳液稳定性以乳析指数（cream index，CI）表征。

式中：V为乳化相体积/mL；V为乳液总体积/mL。

乳滴微观形貌用生物显微镜观察，用Image J软件计算乳滴粒径分布（选取乳滴约300 个）；通过用尼罗红对油相荧光标记，在277 nm激发波长下验证M-APT/CMCS对桉叶精油滴的协同包裹作用；通过流变学剪切速率及表观黏度参数，对不同CMCS质量分数（0.5%、1.0%、2.0%和2.5%）的Pickering乳液样品的流变学特性进行表征。黏弹性模量在0.5 Hz条件下0～100 Pa范围内测量；存储模量（G’）和损耗模量（G”）在1 Pa条件下0.1～100 Hz范围内测量。

1.3.4 桉叶精油Pickering乳液抑菌性能考察

1.3.4.1 抑菌圈直径（diameters of inhibition zones，DIZ）的测定

将100 μL菌浓度为10～10CFU/mL的菌悬液均匀涂布在LB琼脂培养基上。无菌条件下，用直径为6 mm的无菌枪头在含菌培养基上打孔。以无菌水为空白对照，向孔内加入一定体积的桉叶精油和乳液（控制乳液中精油含量与纯精油体积一致）。将培养皿置于37 ℃生物培养柜中培养24 h。培养结束，用十字交叉法测量各DIZ。每个菌种均重复实验3 次，取平均值。

1.3.4.2 最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）的测定

将一系列不同浓度的桉叶精油Pickering乳液与100 μL菌浓度为10CFU/mL的菌悬液室温混匀，然后将其均匀涂布于LB琼脂培养基上，置于37 ℃生物培养柜中培养24 h。以不生长菌样品的最低浓度作为桉叶精油乳剂对该菌的MIC值。每个菌种测试至少重复3 次，取其平均值。

1.3.4.3 桉叶精油Pickering乳液抑菌动力学测定

以金黄色葡萄球菌为受试菌种，通过LB肉汤培养，将菌种浓度调整为5×10CFU/mL。然后将菌悬液转移到离心管中，分别加入桉叶精油和桉叶精油乳剂，控制使二者中桉叶精油质量浓度为1.5 μL/mL。阴性对照为只含有LB肉汤和金黄色葡萄球菌样。上述菌悬液在恒温摇床（37 ℃）上150 r/min振摇孵育不同时间（0.25、0.5、1、2、3、6、12 h）后用紫外分光光度计在600 nm波长处测定金黄色葡萄球菌生存OD值。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 油酸钠改性APT表征

图1 APT（a）、油酸钠（b）和M-APT（c）的傅里叶变换红外光谱图Fig. 1 FTIR spectra of APT (a), sodium oleate (b) and modified APT (c)

如图1所示，谱线a中3 551 cm和1 655 cm处为APT表面O—H的伸缩和弯曲振动吸收峰，1 197 cm和984 cm处为APT晶体结构中Si—O—Si的特征峰，这些峰在M-APT谱线（c）中继续出现。谱线b中2 972 cm和2 865 cm处油酸钠分子链中的—CH、—CH—的C—H伸缩振动吸收峰和1 552 cm和1 449 cm处—COO的特征吸收峰也均原位出现在M-APT谱线（c）中，这说明油酸钠对APT的改性为物理吸附改性。

图2 油酸钠改性APT前（a）和改性后（b）的三相接触角Fig. 2 Three-phase contact angle of APT before (a) and after (b)modification by sodium oleate

图3 APT改性前后粒径分布Fig. 3 Particle size distribution of APT and M-APT

固体粒子润湿性及粒径大小对Pickering乳液稳定性影响至关重要。从图2可知，原始APT θ为15.2°，亲水性很强，不能直接用于稳定Pickering乳液，改性后θ为83.7°，有利于吸附在油滴表面。从图3可知，油酸钠物理吸附改性对APT纳米粒子粒径影响不大，其平均粒径约为84.7 nm。

2.2 影响桉叶精油Pickering乳液稳定性因素

Pickering乳液的稳定性受多种因素的影响，包括固体粒子表面润湿性、粒子用量、油/水体积比等。为克服油酸钠改性APT表面亲水性不足，采用亲水性CMCS链与M-APT协同作用稳定桉叶精油Pickering乳液，单因素法考察M-APT、CMCS用量及桉叶精油体积分数对乳液静置稳定性、乳滴粒径和微观形貌的影响。

2.2.1 M-APT用量对乳液静置稳定性及乳滴粒径的影响

Pickering乳液是通过固体粒子在油滴表面的不可逆吸附并形成空间屏障以防止乳滴聚结。固定CMCS质量分数2.0%、油相体积分数30%，考察不同M-APT质量分数乳液的静置稳定性，如图4所示。当M-APT质量分数小于0.10%，体系经高速剪切分散，静置30 min后，即发生乳析，这主要是因为M-APT量较少时，体系中没有足够的固体粒子吸附在油滴表面，油滴和水相的CMCS溶液亲和作用弱，油滴合并变大，从水相中析出。而当M-APT质量分数不小于0.15%时，足够的M-APT纳米粒子均匀不可逆吸附于油滴表面，并与CMCS链静电吸引，形成稳定的Pickering乳液，即使放置60 d仍可保持稳定。

图4 不同M-APT质量分数桉叶精油乳液在不同静置时间的外观形貌图Fig. 4 Appearance of eucalyptus leaf essential oil Pickering emulsion stabilized with different concentrations of M-APT

M-APT用量对乳滴分布和粒径大小也有重要影响。由图5可知，随M-APT质量分数增加，乳滴粒径减小；当M-APT为0.15%时，其平均粒径最小，为3.67 μm，粒径分布范围也比较窄；当随着M-APT质量分数进一步增加，乳滴粒径略有增大，这主要是因为较多的M-APT吸附在油滴周围，即吸附层增厚，乳滴粒径增大。为了进一步证明M-APT纳米粒子在油滴表面的吸附作用，预先将百里香精油用尼罗红染色，对比观察乳液滴在明场和荧光显微镜下微观形貌，可明显看到红色油滴表面吸附淡黄色的M-APT包裹层（图6）。

图5 不同M-APT质量浓度乳液滴显微形貌图及相应粒径分布计算图Fig. 5 Micromorphology and particle size distribution of emulsion droplets stabilized with different concentrations of M-APT

图6 乳液滴在明场（a）和荧光（b）显微镜下的微观形貌Fig. 6 Micromorphology of emulsion droplets observed under bright field (a) and fluorescence (b) microscope

2.2.2 CMCS用量对乳液静置稳定性及乳滴粒径的影响

固定M-APT质量分数0.15%、油相体积分数30%。由图7可知，CMCS质量分数对乳滴粒径无明显影响，其大小集中在（3.56±0.31） μm之间；CMCS质量分数主要影响乳液静置稳定性。当CMCS质量分数小于1.5%时，乳液在静置3 d后发生明显乳析；而CMCS质量分数不小于2.0%时，乳液CI接近1.0，即使静置60 d仍保持稳定。这主要是因为亲水性的CMCS大分子链在乳液体系中缠绕自组装，其链上的—NH与M-APT表面吸附的油酸钠—COO静电吸引，或二者氢键作用，形成三维网络结构稳定M-APT包裹的精油滴。当其用量较少时，不足以形成三维网络结构，表面亲水作用弱的M-APT粒子包裹的精油滴易合并变大，发生乳析。

图7 不同CMCS质量分数乳液滴平均粒径（a）和静置时间CI值（b）Fig. 7 Average particle size of emulsion droplets with different CMCS contents (a) and CI values as a function of storage time (b)

2.2.3 桉叶精油体积分数对乳液稳定性的影响

固定M-APT质量分数0.15%、CMCS质量分数2.0%，考察桉叶精油体积分数对乳液静置稳定性和乳滴微观形貌的影响，结果如图8、9所示。当精油体积分数大于50%，静置30 min即有少量油相析出浮于乳液表面，析出量随精油体积分数增大而增多（图8，油相尼罗红染色），相应乳滴粒径也随着精油体积分数增多而变大（图9）。这主要是因为M-APT含量在体系中固定，随着精油体积分数增加，油滴表面无法被足够M-APT粒子包覆。因此，在水相中，油滴迅速聚结在一起，以减少界面面积，相应的乳滴粒径增大。

图8 不同桉叶精油体积分数乳液静置稳定图Fig. 8 Appearance of emulsion with different concentrations of eucalyptus essential oil

图9 不同桉叶精油体积分数乳液乳滴显微形貌图Fig. 9 Micromorphology of emulsion droplets with different volume fractions of eucalyptus essential oil

2.3 M-APT/CMCS协同稳定桉叶精油Pickering乳液的流变学行为

图10 不同CMCS质量分数乳液流变学行为曲线Fig. 10 Rheological curves of eucalyptus essential oil Pickering emulsion with different contents of CMCS

Pickering乳液的流变性能可反映其微观结构和抗乳化稳定性。CMCS在pH 6.0体系中Zeta电位3.22，荷正电，在乳液中主要通过大分子链缠绕自组装，形成三维网状结构，通过静电引力将表面荷负电的吸附M-APT粒子的油滴包裹其中，阻止油滴合并变大和沉降。为进一步验证CMCS在乳剂体系中的作用，测定不同CMCS质量分数的桉叶精油Pickering乳剂的G’和G”随频率变化关系，结果如图10a所示。随着CMCS质量分数增加，乳液的G’明显增大，说明乳液的黏弹性增强。而且，当CMCS质量分数大于1.0%时，其G’大于G”，tanδ小于1，乳液表现典型的“弹性凝胶”行为（图10b）。这种质量分数依赖的凝胶流变行为在其他多糖粒子稳定的Pickering乳液体系中也有报道，这主要是因为多糖大分子链在连续相中的氢键缠绕形成三维网状结构。凝胶网络的形成，可将油滴固定在其网络空隙结构中，阻碍了液体膜的排液和油滴的聚结，乳液稳定性更强。

2.4 桉叶精油Pickering乳液抑菌性能

通过琼脂扩散法对比考察桉叶精油和其乳液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和黄曲霉菌的抑制性能，如图11所示。对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制活性明显优于大肠杆菌和黄曲霉菌，此结果与相关文献报道一致。十字交叉法测定的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌体系培养12 h和24 h的DIZ结果如表1所示。所有乳液体系DIZ值均大于纯精油体系。这主要是因为M-APT与CMCS协同作用实现了对精油的包封，提高了精油在水相体系中的分散性，增大了与菌类的接触面积，可快速的侵入其细胞膜，导致内容物外泄，抑菌活性提高。此结果与Jiang Yang等报道的以玉米果胶复合纳米颗粒作为稳定剂制备的肉桂精油Pickering乳剂的分散性和抑菌活性优于纯肉桂精油一致。另外，对所有菌种，精油添加组在培养24 h后，DIZ值略降低，而乳液组均增大，这证实了M-APT/CMCS协同对精油滴的包封和缓释作用。梯度法测得的桉叶精油乳液对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC值为18.0 μL/mL和12.5 μL/mL（图12）。

图11 桉叶精油及其乳液的抑菌性能对照图Fig. 11 Aantibacterial activity of eucalyptus essential oil and emulsion

表1 桉叶精油及其乳液对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌培养12 h和24 h的DIZ值Table 1 DIZ values of eucalyptus essential oil and emulsion against S. aureus and B. subtilis at 12 h and 24 h

图12 桉叶精油乳液对金黄色葡萄球菌（A）和枯草芽孢杆菌（B）的MIC值测定图Fig. 12 MIC values of eucalyptus essential oil Pickering emulsion against S. aureus (A) and B. subtilis (B)

为了进一步验证M-APT/CMCS协同对精油的包封，以金黄色葡萄球菌为受试菌种，通过菌类生长动力学实验考察M-APT/CMCS协同稳定桉叶精油乳液的缓释抑菌性能，如图13所示。在空白组中，随着时间延长，金黄色葡萄球菌悬浮液OD值持续升高；纯CMCS体系在起初1 h OD值略有降低，表现弱的抑菌活性；纯桉叶精油组OD值在起初3 h内下降，但随后略有升高。这主要是因为精油水溶性低，易挥发，与水相菌悬液中菌种不能充分接触。而桉叶精油Pickering乳液组的OD值随时间延长呈现持续下降趋势，6 h后OD值小于0.05。这一结果也验证了M-APT/CMCS对精油的包封，减小精油挥发和增大与菌种的接触面积，不仅可实现长效抑菌，而且提高抑菌活性。

图13 桉叶精油及其Pickering乳液对金黄色葡萄球菌的缓释抑菌生存曲线Fig. 13 Survival curves of S. aureus in LB broth containing eucalyptus essential oil and Pickering emulsion

3 结 论

以油酸钠对APT表面润湿性进行适当改性，使其θ从15.2°增大到83.7°，可不可逆吸附在油滴表面，与CMCS链协同作用制备了桉叶精油Pickering乳液。考察M-APT、CMCS质量分数以及油相体积分数对乳液稳定性影响，结果表明，当M-APT质量分数0.15%、CMCS质量分数2.0%、油相体积分数30%时，制备的乳液静置60 d仍保持稳定。荧光显微镜分析和流变数据表明，M-APT在油/水界面吸附，CMCS在连续相中自组装形成三维网状结构，将吸附M-APT的油滴镶嵌其中以形成稳定的Pickering乳液。琼脂盘打孔法对比考察桉叶精油和乳液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和黄曲霉菌的抑菌活性，发现其对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有显著的抑制活性，且乳液体系的DIZ值大于纯精油体系，并表现延长的抑菌活性，这主要是因为M-APT粒子在油滴表面吸附实现了对精油的包封，降低了其挥发性。菌类生长动力学实验也证明了这一结果，即M-APT/CMCS协同作用可实现对精油的包封和缓释，提高抑菌活性和延长抑菌时间，这对拓展植物精油在生物抑菌剂方面的应用具有重要参考价值。