吉林延边地区边境县蜱和牛携带东方泰勒虫感染调查

李基旭 朴 文 金永善 金光俊 崔青龙 宋振海 朴光明 金龙浩 李永男 付 鹏

(1.延边朝鲜族自治州疾病预防控制中心，吉林延吉 133001；2.珲春市疾病预防控制中心，吉林珲春 133300； 3.图们市疾病预防控制中心，吉林图们 133100；4.龙井市疾病预防控制中心，吉林龙井 133400； 5.和龙市疾病预防控制中心，吉林和龙 133500)

东方泰勒虫Theileriaorientalisi旧称瑟氏泰勒虫Theileriasergenti，寄生于动物红细胞或淋巴细胞内，可以引起牛东方泰勒虫病，严重时引起牛急性死亡(杨艳玲等，2007)。延边黄牛是吉林省延边地区特有的黄牛品种，是我国五大地方良种牛之一，已被国家农业部列为重点保护和开发品种。但一直以来，当地较高的牛东方泰勒虫感染率(李红旺等，2017)给当地养牛产业发展带来较大风险。据文献报道，牛东方泰勒虫病由蜱传播，具有明显的季节性，主要感染放牧牛群(张守发等，1997)。延边地区具有丰富的森林、草原资源，当地养牛户大都采取了放牧和圈养相结合的方式。据笔者调查，延边地区适宜蜱类生长，蜱类分布非常广泛，而且具有明显的种类多样性和地域分布特征(李基旭等，2017)。该地区又位于中国、朝鲜、俄罗斯3国边境地带，边境线较长，蜱等媒介生物极易越境迁徙，可能导致牛东方泰勒虫病等蜱传疾病跨境传播和蔓延。为了解延边地区边境县游离蜱和牛携带东方泰勒虫情况，开展了此次调查研究。

1 材料与方法

1.1 样本来源

2019年4—8月在延边州珲春、图们、龙井、和龙市用布旗法采集游离蜱，采集生境为大型森林或林场附近草丛。5—6月在延边州珲春、图们、龙井市每县选择1个村屯随机采集黄牛静脉血，每只采1 份，每村采10份。

1.2 试剂和引物

核酸提取盒购自中国江苏硕世生物科技股份有限公司，PCR预混试剂为PromegaGotaq@Colorless Master Mix,USA。参照Yu等(2011)合成检测东方泰勒虫MPSP (major piroplasm surface protein, MPSP) 基因引物，由中国上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 蜱虫分类

挑选虫体完整的蜱，参照文献(Yamagutietal.，1971; 陆宝麟等，2003)进行鉴定。不同蜱种分组，成蜱每组5只(分雌、雄)，若蜱每组1～15只，幼虫不计入。

1.4 提取样本核酸

每组蜱用磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffer saline, PBS)冲洗3次后，放入1.5 mL离心管中，再加600 μL PBS，使用组织破碎仪进行研磨，研磨后6 000 r/min 离心1 min，取上清200 μL， 按提取盒说明书提取核酸(磁珠法)。取牛静脉血200 μL按提取盒说明书提取核酸(磁珠法)。

1.5 检测东方泰勒虫MPSP基因

扩增体系为上下游引物10 μmol/L各1 μL，DNA模板5 μL，使用PCR预混试剂配制25 μL体系。反应条件为95 ℃ 2 min，1个循环；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min，1个循环。反应结束后，使用德国凯杰公司(Qiagen)的毛细管电泳系统(QIAxcel screen Gel)检测特异条带。

1.6 基因测序和遗传进化分析

将阳性扩增产物送往中国上海生工生物工程股份有限公司进行测序，并使用DNAStar软件进行基因序列拼接和校正，与NCBI的DNA序列数据库中默认序列进行一致性分析，并用Mega 5.0软件构建系统进化树，牛巴贝虫Babesiabovis和犬新孢子虫Neosporacaninum表面蛋白基因序列作为外群。

1.7 统计分析

使用Excel 2007 表格进行数据录入。蜱病原感染情况计算最低感染率(minimum infection rate per 100 ticks，MIR)=阳性组数/蜱虫数×100%。牛病原感染情况计算阳性率。采用Pearson卡方检验、Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蜱种构成及分布

共采集游离蜱1 183只，其中成蜱459只，若蜱724只。森林革蜱Dermacentorsilvarum占8.45%(100/1 183)；嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna占10.65% (126/1 183)；日本血蜱Hae.japonica占17.33%(205/1 183)；长角血蜱Hae.longicornis占54.18%(641/1 183)；全沟硬蜱Ixodespersulcatus占9.38%(111/1 183)(表1)。

表1 延边地区4县蜱种分布

2.2 蜱东方泰勒虫MPSP基因检测结果

把1 183只游离蜱共分成172组。经东方泰勒虫MPSP基因检测，蜱东方泰勒虫最低感染率(MIR)为1.52%。只有在长角血蜱组中检测到阳性结果，其最低感染率(MIR)为2.88%(表2，图1)。经统计，不同蜱种最低感染率存在差异，有统计学意义(χ2=41.644，P<0.05)。(表2)。

图1 部分蜱样品组东方泰勒虫MPSP基因扩增结果

表2 延边地区4县游离蜱东方泰勒虫检测情况

2.3 牛静脉血东方泰勒虫MPSP基因检测结果

共采集30份牛静脉血，10份阳性，阳性率为33.33%，均由图们市牛血样品中检测到(图2)。

图2 牛静脉血样品东方泰勒虫MPSP基因扩增结果

2.4 东方泰勒虫MPSP基因同源性与系统进化分析

从蜱类东方泰勒虫MPSP基因扩增产物中随机选择1份样品进行双向测序得到的基因序列(GenBank登录号：MN982295)与NCBI GenBank基因库中的牛瑟氏泰勒虫(东方泰勒虫)MPSP基因序列(DQ078264)同源性达到了99.54% ；从牛血阳性样品中随机选择进行双向测序得到的基因序列(GenBank登录号：MN982296)与NCBI GenBank基因库中东方泰勒虫MPSP基因序列(KY392971)同源性为99.88%。经系统进化分析，蜱源和牛源东方泰勒虫MPSP基因序列处于同一分枝(图3)。

图3 基于蜱源和牛源东方泰勒虫MPSP基因片段构建的遗传进化树

3 讨论

东方泰勒虫病在我国流行广泛，对畜牧业的影响很大，引起牛高热、贫血、出血、黄疽、体表淋巴结肿大等临床症状，严重时可以引起牛急性死亡(张守发等，1997)。东方泰勒虫病在吉林东部山区和西部平原地区均有流行，延边地区牛感染东方泰勒虫现象非常严重(李红旺等，2017)。东方泰勒虫病在我国的贵州、甘肃、陕西、青海、河北、辽宁等地区也有流行。目前认为，蜱是牛东方泰勒虫病的传播媒介(李鸣等，2016)。为确认延边州边境地区牛东方泰勒虫病的可能感染来源，进一步证实蜱的传播媒介作用，本研究采取对蜱类和牛分别检测东方泰勒虫的方法，并通过基因序列比对，对牛东方泰勒虫病可能感染来源进行了分析。据文献报道，牛东方泰勒虫 MPSP 基因已作为流行病学调查和系统发育学研究的标志性蛋白基因(Inoueetal.，2001)，因此，本研究选择该基因作为目标基因。结果表明，本研究在本地区长角血蜱和黄牛中均检测到了东方泰勒虫MPSP基因片段，且两个基因序列同源性较高，遗传关系较近 。据文献报道，长角血蜱常寄生在家养动物，可以传播多种病原体，对家畜以及人类健康影响较大(Jiangetal.，2018)。据本次调查，长角血蜱主要分布在延边地区珲春市和图们市，为珲春市的优势种。虽然本研究未在珲春市牛血液样品中检测到东方泰勒虫(可能样本量少)，但一些学者已经证实珲春市牛的东方泰勒虫感染率较高(李红旺等，2017)。结合本研究在长角血蜱样本中检测到东方泰勒虫的情况，我们首先从流行病学角度推断长角血蜱可以成为牛东方泰勒虫病的传播媒介。通过基因序列溯源分析，我们可以进一步推断牛体内的东方泰勒虫可能来源于长角血蜱。因此，我们认为长角血蜱可能是牛东方泰勒虫病的传染源或传染途径之一 ，同时可以确认长角血蜱在传播牛东方泰勒虫病的过程中可能会起到重要的媒介作用。这与一些学者认为长角血蜱是东方泰勒虫的主要传播媒介(高旭等，2005)的观点相符。本研究还发现，同样具有长角血蜱分布的图们市牛东方泰勒虫感染率较高，虽未在图们市长角血蜱中检测到东方泰勒虫(可能与样品数量少有关)，但我们可以推断牛东方泰勒虫感染率可能与长角血蜱分布相关。当然，下一步还需要通过增加样本量等方式进行更深入的研究。本研究还应该继续采取检测基因多样化、独立样本检测等方式进一步提高其研究结果的可靠性。