饮料中合成着色剂测定方法研究进展

孔兰芬，高敏

(云南轻纺职业学院，昆明 650300)

色泽是人类对美食最直接的评判指标之一，食品的色泽来源于食品中的主要色素。色素依据原料来源分人工合成和天然色素[1-3]；按其分子结构，可分成偶氮类、二苯甲烷吸附类和氧蒽类等；按溶解性可分成脂溶性和水溶性。食用色素又称为着色剂，其炫彩的颜料可使饮食赋予亮丽的色彩而被广泛使用[4]。其中，天然色素一般源于从动物、植被、细菌组织中获得的颜色。食用的天然着色剂可包括多烯类、呋咯类、醌类、多酚类以及酮类。天然色素安全性高，兼有营养强化作用、色时色调比较自然、具有芳香气味等特点；而人工的全合成着色剂则包括了有机着色剂与无机着色剂，与无机着色剂相比，有机着色剂具有种类多、颜色艳丽、染色能力较强、透明度好、密度小、用量少等特点。食物中的合成着色剂，因其色泽鲜艳、不易变色且售价低廉，而在食物制造中应用广泛[5-6]。

自然界的颜色不稳定，人类在制造食物的过程中会人为的加入某些食品添加剂——食用合成着色剂，来保持食品外表色彩的鲜丽[7]。随着经济社会的日益发达和民众生活的逐步改善，越来越多的消费者更加注重食品的营养搭配是否均衡，食品是否色香味俱全，因此生产者往往会在食品加工过程中添加着色剂，以此来改善食品的色泽。

人工合成着色剂有着鲜艳的色彩，添加到各种食物当中可锦上添花，食物不仅变得好看，色泽也相对艳丽，跟天然着色剂相比价格更为便宜，性质更为稳定[5]，因此食品加工公司更多使用人工合成着色剂，而忽视了人工合成着色剂利用过度、人类摄入量过大所产生的负面影响[8-9]。如果长期摄食过量的人工合成着色剂，将会造成生育力的降低，影响幼儿智力正常发育，导致幼儿行为过激。某些人工合成色素(譬如偶氮化物类人工合成着色剂)在人体内会转换成致癌化学物质[10-13]。为了防止滥用人工合成的着色剂，世界各国都通过立法严格控制食物中人工合成着色剂的用量[14-15]。我国GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[16]中对可以利用的合成着色剂品种、应用范围以及最高限量均有具体规定。

常见的合成着色剂有柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红等[17]，对其检测方式主要有伏安法[18]、高效液相色谱法[19-24]、液相色谱-质谱联用法[25-26]、毛细管电泳法[27-28]、薄层色谱法[29]、示波极谱法[30-31]等。笔者围绕饮料中合成着色剂的各种测定方法展开剖析，为后期探索出更加简便、快速、精确、适用的测定方法提供参考。

1 饮料的定义及分类

饮料是指以水为基本原材料，由不同的配方与制作工序所生产出供人类直接食用的液态物质。除了供给水分之外，某些饮料中还富含不等量的糖类、酸、乳、钠、脂类、能源和各类氨基酸、维生素、多种无机盐等营养素化学物质，具有相当的营养。根据GB 2760—2014 《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[16]规定，饮料分为包装饮用水，果蔬汁类及其饮料，蛋白饮料，碳酸饮料，茶、咖啡、植物(类)饮料，固体饮料，特殊功能饮料，风味饮料，其它类饮料等9 类。

2 饮料中的着色剂

根据GB 2760—2014 《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[16]中规定，被限量使用的着色剂主要有60 种，可用于饮料中的着色剂有48 种，着色剂在添加到9 类饮料的过程中，果蔬汁类及其饮料类可添加43 种，蛋白饮料类可添加25 种，碳酸饮料类可添加33 种，茶、咖啡、植物(类)饮料类可添加14 种，固体饮料类可添加20 种，特殊功能饮料类可添加14 种，风味饮料类可添加41 种，其它类饮料可添加13 种。从各类添加的着色剂种类数看，果蔬汁类及其饮料类、风味饮料类是添加着色剂的主要两大类，也是添加合成着色剂最多的两类。

3 饮料中合成着色剂的测定方法

3.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法因仪器保有量大、灵敏度高、操作简便等优点而被普遍应用[20]。GB 5009.35—2016[32]、GB 5009.141—2016[33]以 及SN/T 1743—2006[34]中规定，食品中合成着色剂检测方法均为高效液相色谱法，然而该方法存在样品处理及梯度洗脱程序耗时长、步骤繁琐等不足[35]，所以后续的研究对此不足进行了改进，以适应大批量样品的检测需求。

何颖等[36]研究了市售的散装饮料中5 种人工合成着色剂的高效液相色谱测定方法。李丹梅[35]使用高效液相色谱法，同时检测了饮料中5 种合成着色剂。张卉[37]使用高效液相色谱法，同时测定了饮料中6 种人工合成着色剂。高家敏等[38]使用高效液相色谱法检测饮料中12 种水溶性合成着色剂。戴玉婷等[39]使用固相萃取-高效液相色谱法检测饮料中的9 种人工合成着色剂。张敏等[40]使用固相萃取高效液相色谱法检测碳酸饮料中的7 种合成着色剂。邹沫君等[41]成功研制一种检测果汁饮料中7 种合成色素的效液相色谱法。张敏莉等[42]使用高效液相色谱法，同时检测有乳饮料中7 种合成着色剂。汪强等[20]采用固相萃取-高效液相色谱-光二极管阵列检测法测定了饮料中9 种人工合成着色剂。

整理上述文献方法，对柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄4 种合成着色剂测定的样品处理方法、相关色谱条件、相关系数、检出限、测定结果的相对标准偏差和加标回收率等数据见表1。由表1 可知，9种文献方法的样品处理方法主要有固相萃取法、聚酰胺粉吸附法和超声提取法3 种。由于有机溶剂气体总量较低，利用固相萃取法能够大幅减少对周围环境的污染，同时选择高效、高选择性的吸收物质，能够更高效的把解析物质与干扰性组分隔离，简化无相分离过程，容易得到解析物质，且回收率和富集倍率较高，使用简便、快捷；采用超声提取法可大大提高有机着色剂的的综合提取利用效率[43]；而采用聚酰胺粉吸附法时，聚酰胺粉的吸附能力会受外界环境的影响，回收率较低，同时操作步骤复杂，不适合大批量样品的处理[44]。9 种文献方法所用色谱柱均为十八烷基硅烷键合硅胶填料柱，且粒径和柱径均一致，柱长相近，但来自不同的品牌，各品牌填料材质和装填方式等也各有差异，所以分析结果也会有所不同。柱温、流量、流动相差异不大，但4 种合成着色剂的运行时间有所差异，大多在10 min 左右出峰，文献[42]方法的时间偏长，在17 min 左右。一个检测方法的优劣除了考虑简便、快捷外，还需考虑方法数据结果的灵敏度、精密度和准确度，通过表1 中数据可看出，4 种文献[20，38，40-41]方法的灵敏度、精密度和准确度均较高。

表1 高效液相色谱法测定合成着色剂的分析条件及特点

3.2 超高效液相色谱法

张海瑞等[45]利用超高效液相色谱法对食品中10 种合成着色剂的含量进行测定。赵卉等[46]利用超高效液相色谱法研究分离饮料中7 种合成着色剂。上述两种超高效液相色谱方法测定柠檬黄、苋菜红、胭脂红和日落黄4 种合成着色剂的样品处理方法、色谱条件、相关系数、检出限、重复性、回收率等数据见表2。

由表2 可知，两种方法的样品处理方法是固相萃取法和聚酰胺粉吸附法，虽然两种方法测定结果可以接受，但聚酰胺粉吸附法繁琐、耗时。两种方法的色谱柱均为沃特斯公司生产，粒径和柱径均一致，柱温、流动相差异也不大，且两种检测方法的灵敏度、精密度和准确度均较高，但文献[46]方法中色谱柱较短，流动相流量偏大，出峰时间在2 min以内，容易受末端吸收或溶剂峰的影响，因此文献[45]方法更值得推荐。

3.3 液相色谱-质谱联用法

张勋等[47]利用液相色谱-串联质谱法对多种食品中的16 种合成着色剂进行了检测，样品处理方法为固相萃取法，除个别目标物回收率偏低、测量准确度受仪器性能影响之外，其分析灵敏度、精密度和准确度均在可接受范围内。特别是由于质谱具有定性准确的优势，该法具有推广价值。该方法的分析条件及特点见表2。

3.4 绿色高效液相色谱法

张秋菊等[48]利用绿色高效液相色谱法测定饮料中4 种人工合成着色剂，胡贝等[49]利用离子液体双水相萃取-高效液相色谱检测饮料中的8 种人工合成着色剂。上述两种分析方法的样品处理分别采用了超声波萃取法和离子液体双水相提取法。离子液体双水相系统综合了离子液体与双水相系统的优势，分相持续时间短，黏度较低，在提取过程中不易于乳化，提取率高，分离条件缓和，离子体系易于回收使用，绿色环保[50]。

上述两种绿色高效液相色谱法的分析条件及特点见表2。由表2 中可知，尽管文献[48]方法检出限偏高，文献[49]方法平均回收率偏低，但两种方法的灵敏度、精密度和准确性均满足分析要求。这类方法一般不使用有机溶剂，绿色无污染[51-54]，该方法简单、快速、精确、灵敏，将是未来检测的发展方向。

表2 超高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法及绿色高效液相色谱法分析条件及特点

3.5 分光光度法

孙延春等[55]利用分光光度法测定饮料中色素含量。该方法根据吸光度的加和性，用联立方程组求解了饮料中柠檬黄和胭脂红的含量，结果柠檬黄和胭脂红加标回收率分别为89.7%、90.6%，测定结果的相对标准偏差分别为2.89%、2.57%（n=6），准确度和精密度满足分析要求。该法试样无须预处理，操作简便，易推广。

3.6 薄层色谱法

张兰天等[56]利用KH-3000 型薄层色谱扫描仪，采用薄层色谱法研究了同时快速检测饮料中26 种人工色素的方法。部分合成着色剂的试验结果数据见表3。由表3 中可知，在26 种人工色素中，选取的8 种合成着色剂重复性偏低，平均回收率虽均在80%以上，但准确度相对偏低。

表3 薄层色谱法测定合成着色剂的试验结果 %

以柠檬黄为例，对几种文献方法进行比较，结果见表4。

表4 柠檬黄不同方法的测定结果 %

从表4 可以看出，7 种不同的方法测定的柠檬黄含量，方法不同，所采用的仪器也不同，得出的结果也不同。总体上看，利用高效液相色谱仪测定的方法比紫外分光光度法和薄层色谱法准确度更高，重复性更好。

4 结论

分光光度法测定合成着色剂仪器操作较简便。高效液相色谱法主要应用于检测饮品、硬糖、配制酒、蜜饯中的合成着色剂，是目前应用范围最广泛，研究成果量最大的方法。该法的灵敏度高，操作简便，精确度高，推广性强，并被长期沿用至今。也正是由于高效液相色谱法的上述优点，在GB 5009.35—2016、GB 5009.141—2016 及SN/T 1743—2006 中规范的食物中合成着色剂测定方式均为高效液相色谱法。同时，由高效液相色谱法所派生出的超高效液相色谱分析法、液相色谱-质谱联用法以及绿色高效液相色谱法也受到了不少学者的研究，并获得了很好的广泛应用。超高效液相色谱法用在快速方面，液相色谱-质谱联用法在精确定性方面，而绿色高效液相色谱法用在环保方面发挥着它们各自的优势。

总之，高效液相色谱法测定合成着色剂，比分光光度法和薄层色谱法的精密度、准确度更高。另外，样品处理方法的研究也是一个探索的方向，发展快速、高效、稳定、准确、环保的样品处理方法是未来的技术趋势。利用超声萃取法作前处理，可极大地提高了有机着色剂的的综合萃取效率，且数据结果的重复性和精度也较好；使用固相提取法，由于受固定相的吸附和洗脱物的特性影响，重复性和准确度都需要逐步摸索，而此法的有机溶剂消耗量较低，因此能够大大减少对周围环境的污染，同时使用比较高效、有选择性的吸附物质，可以比较高效的把分析物质和干扰组分隔离；而使用离子液体双水相提取法，则可以综合利用离子液体和双水相系统的优势，从而达到分相时间较短、粘度显著降低、提取过程中不易乳化、绿色环保等目的。