顶坛花椒不同季节萌发枝条的果皮氨基酸累积特征

王登超，符羽蓉，喻阳华，陈卯，韦昌盛

（1贵州师范大学地理与环境科学学院，贵州贵阳 550025；2贵州师范大学喀斯特研究院/国家喀斯特石漠化防治工程技术研究中心，贵州贵阳 550001；3贵州省贞丰县林业局，贵州黔西南布依族苗族自治州 562200）

0 引言

【研究意义】顶坛花椒（var.）系芸香科（Rutaceae）花椒属（）落叶灌木或小乔木，是竹叶椒（）在贵州喀斯特地区特有的变种（Appelhans et al.，2018）。因其具喜钙、耐旱、适应性强的特性（李苇洁等，2010），适宜生长在喀斯特干热河谷地区，可用于石漠化治理和生态恢复。同时，其果皮富含氨基酸、芳香油和脂肪酸等多种物质（屠玉麟，2000），以香味浓、麻味纯、品质优著称，营养价值丰富，成为药食同源植物，是重要的调料植物。目前顶坛花椒已在黔中和黔西南等石漠化地区广泛种植，成为石漠化治理和山区经济建设的重要经济树种（喻阳华等，2019）。但是，近年来受连栽、土壤施肥不足及树体管理不当等影响，导致顶坛花椒果实出现直径降低、香麻味退化和减产甚至不产等现象（敖厚豫，2020），亟需优化培育技术，为顶坛花椒果皮营养品质改良提供理论依据。【前人研究进展】氨基酸作为顶坛花椒的主要品质指标，其风味氨基酸对花椒香味有一定贡献（侯娜等，2017），而缬氨酸（Val）和亮氨酸（Leu）是合成麻味素含氮部分的前体物质（Greger，2016），其含量高低对花椒麻味特性具有一定影响。果实氨基酸含量不仅受品种及性状（Zhou et al.，2018；Li et al.，2022）、栽培区气候和土壤条件等影响（刘伟等，2019；Wen et al.，2020），还与枝条管理密切关联（贾邱颖等，2020；Zhang et al.，2021）。枝梢作为果树产量和品质形成的基础，其长度、粗度和叶片数等会影响果实产量与品质（杜玉霞等，2017），枝条长势旺、叶片数多，捕光充分、利于可溶性固形物的形成，进而使较多的固形物转移到果实中，提高果实品质（李培环等，2012）。枝条萌发季节亦可影响果实氨基酸积累，不同季节萌发枝条因光、水、热等环境因子差异，春季的温、湿度和光照强度等条件较为温和，光辐射弱，植株氮代谢加快，利于氨基酸合成（Kovinich et al.，2014）；冬季大部分氨基酸储存在根茎中，并在春季运输到生长组织，增强了枝梢氨基酸积累（Lähdesmäki et al.，1990）；夏、秋季的光、温、水等环境因子有利于含碳化合物的合成与积累，碳代谢加快，氮代谢减弱，导致枝梢氨基酸积累量减少（陈双林，2009），果树在果实生长期，枝叶上合成的大量含氮同化物供给果实生长发育（Staswick，1994），增强了果实氨基酸积累。可见枝条萌发季节对氨基酸积累有较大影响。【本研究切入点】前人虽然已经做了大量有关树体管理对果实氨基酸积累的影响，而有关顶坛花椒不同季节萌发枝条果皮氨基酸的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】选取黔中喀斯特高原峡谷区顶坛花椒人工林为研究对象，分析其不同季节萌发枝条的顶坛花椒果皮氨基酸含量与组分特征，旨在探讨顶坛花椒枝条萌发季节对果皮氨基酸含量及积累量的影响效应，阐明植物氨基酸积累量间的内在关联，为顶坛花椒人工林产量和品质的提升提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

样地位于贵州省黔西南州贞丰县北盘江镇（东经105°38′11″、北纬25°40′16″），属亚热带季风气候，年均降水量约1100 mm，但季节差异较大，降水多集中在夏、秋两季，冬、春旱及伏旱严重（李红和喻阳华，2020）；年均气温18.4℃，年极端高温和极端低温分别为32.4和6.6℃，冷热季节分界明显，光热资源充沛。研究区内地势起伏大，属典型的喀斯特高原峡谷地貌；土壤以石灰岩及大理岩发育的石灰土为主，土壤呈现表层浅薄、斑块化分布的特点，且水、热、气、肥不平衡，钙、镁等矿物质含量较高。研究区主要经济植物有顶坛花椒、金银花（）、核桃（）等。该区域大规模推广顶坛花椒种植已30年，由于花椒人工林在长期的生产经营过程中存在结构单一、生产力低、管理方式粗放和缺乏科学管理等问题，导致产量及品质下降，降低了椒农的生产积极性，严重限制了石漠化地区顶坛花椒特色产业的发展，制约着石漠化地区顶坛花椒人工林生态功能的提升。

1.2 样品采集、处理与测定

1.2.1 样品采集于2021年6月顶坛花椒果实成熟期采摘。在同一种植园内，分别选取春、夏、秋季萌发枝条作为骨干枝的顶坛花椒样树各3株，依次标记为春梢、夏梢、秋梢，各处理结构参数及采样时间见表1。试验设置3个重复。在各样树分别采集同一类型不同植株相异枝条的上、中、下部位无损花椒果实，装入自封袋保存，在阳光下自然晾干、去籽、研磨成粉，用于氨基酸含量测定。

1.2.2 氨基酸含量测定参考《食品中氨基酸的测定》（GB 5009.124—2016），顶坛花椒果皮氨基酸组分及其含量使用高效液相色谱法测定。药用氨基酸（MAA）包括精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）9种。根据其味觉特征可将其分为鲜味氨基酸（DAA）、苦味氨基酸（BAA）、甜味氨基酸（SAA）、芳香族氨基酸（AAA）4类。

1.3 氨基酸营养评价

根据氨基酸比值系数法，将花椒果皮的氨基酸组成与1973年联合国粮农组织和世界卫生组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，FAO/WHO）提出的EAA标准模式进行比对，参照孙娟娟等（2019）、颜孙安等（2021）的方法计算风味氨基酸含量与味觉阈值（Ratio of content and taste threshold，RCT）、氨基酸比值（Amino acid ratio，RC）、氨基酸比值系数（Amino acid ratio coefficient，RCAA）和氨基酸比值系数分（Amino acid ratio coefficient score，SRC）等参数，并对其不同季节萌发枝挂果果皮的营养价值进行评价和讨论。RCT＜1时，表征该氨基酸对花椒特殊风味无贡献；RCT≥1时，该氨基酸会影响花椒特殊风味，且RCT越大贡献率越高。RC最小的氨基酸为第一限制氨基酸，RC＞1时，说明该氨基酸相对过剩；当RC＜1时，表明相对不足；RC=1时，其组成比例与模式谱一致。SRC越小，营养价值越低，SRC越接近100，营养价值越高。

1.4 数据处理与统计分析

利用单因素方差分析（One-way ANOVA）检验不同季节萌发枝挂果果皮氨基酸积累特征之间的差异。利用Duncan’s多重比较探明春梢、夏梢和秋梢氨基酸组分含量的差异，采用Pearson相关分析法对处理中果皮氨基酸进行相关性检验。利用主成分分析法（PCA）评价不同季节萌发枝梢挂果果皮氨基酸品质，氨基酸含量数据经标准化处理后进行PCA，以特征值大于1为原则，确定主成分个数；经PCA提取主成分后进行综合评价，依据各主成分分值（）及相应特征值的方差贡献率权重相乘后求和得到综合评分（）。数据整理、分析、作图等采用Excel 2019、SPSS 26.0及Origin 2019b等完成。

2 结果与分析

2.1 枝条萌发季节对顶坛花椒果皮氨基酸含量的影响

如表2所示，顶坛花椒果皮包含17种氨基酸，春梢和夏梢的各氨基酸含量均高于秋梢。其中，春梢和夏梢的异亮氨酸（Ile）含量、春梢的赖氨酸（Lys）含量及必需氨基酸/总氨基酸（EAA/TAA）、非必需氨基酸/总氨基酸（NEAA/TAA）、必需氨基酸/非必需氨基酸（EAA/NEAA）均显著高于秋梢（＜0.05，下同），夏梢的果皮Lys含量与秋梢差异不显著（＞0.05，下同）；春梢和夏梢的Ile含量（0.49 mg/g）为秋梢（0.05 mg/g）的9倍以上；其他氨基酸未随枝条萌发季节发生显著变化。此外，除Asp外，其余种类氨基酸均在春梢达峰值、夏梢次之。各氨基酸含量大小总体上表现为春梢＞夏梢＞秋梢。根据FAO/WHO提出的理想蛋白质中EAA/TAA为40.00%、EAA/NEAA高于60.00%，本研究中春梢和夏梢顶坛花椒果皮的EAA/TAA（38.99%）和EAA/NEAA（63.91%）更符合标准。除常见的Thr、Val、Met、Phe、Ile、Leu和Lys等7种必需氨基酸外，顶坛花椒还包括2种儿童氨基酸（His和Arg），其含量为567.6～720.3 mg/kg，占总氨基酸的9.62%～10.28%，在春、夏、秋梢间逐渐降低，但差异不显著。

表1 顶坛花椒试验样地概况Table 1 Basic information of Z.planispinum var.dingtanensis test plot

表2 顶坛花椒不同季节萌发枝条的果皮氨基酸含量（n=3）Table 2 Amino acid content in pericarp of germinating branches of Z.planispinum var.dingtanensis in different seasons（n=3）

2.2 顶坛花椒不同季节萌发枝条的果皮氨基酸积累量

2.2.1 游离氨基酸及风味氨基酸积累量由图1-A可知，EAA、NEAA、TAA和CEAA等游离氨基酸在数值上均为春梢＞夏梢＞秋梢；除EAA含量为春梢和夏梢显著高于秋梢外，其余均无显著差异，秋梢的EAA含量较春梢和夏梢分别降低35.53%和32.98%。如图1-B所示，总体上，SAA含量（2.15～2.70 mg/g）最高，AAA含量（0.30～0.41 mg/g）最低，BAA含量（1.38～2.20 mg/g）与DAA（1.68～2.14 mg/g）相近，各处理中风味氨基酸含量随季节变化趋势与EAA一致；秋梢的BAA含量（1.38 mg/g）显著低于春梢（2.20 mg/g）和夏梢（2.06 mg/g），但春梢的BAA含量与夏梢不显著；除BAA外其余风味氨基酸含量在不同季节萌发枝条处理间差异均不显著。从RCT值看，处理中仅Asp、Glu、Arg和Cys的RCT＞1，且这4种氨基酸含量在春梢、夏梢和秋梢间逐渐减少（表3）。因此，Asp、Glu、Arg和Cys是形成花椒独特风味的原因之一，且春梢和夏梢更利于氨基酸积累和特殊风味的形成。

2.2.2 特殊氨基酸积累量及组成由表4可知，顶坛花椒不同萌发季节枝梢挂果果皮MAA总量为3.27～4.20 mg/g，以春梢含量最高。不同处理中AAA和BCAA总量范围分别为0.30～0.41 mg/g和0.96～1.67 mg/g，其含量在春梢、夏梢和秋梢间逐渐减少，其中秋梢的BCAA和BCAA/AAA显著低于春梢和夏梢，而秋梢的MAA/TAA显著高于春梢和夏梢，但秋梢的MAA总量较低。MAA和AAA总量在处理间差异不显著。BCAA/AAA（3.18～4.07）均高于正常人体的支链氨基酸/芳香族氨基酸比值（支/芳比）（3.0～3.5）。表明顶坛花椒果皮中富含丰富的药用氨基酸，且春梢和夏梢更利于花椒果皮药用氨基酸积累。

2.3 顶坛花椒不同季节萌发枝条果皮氨基酸的相关分析

对3个处理顶坛花椒果皮氨基酸组分进行相关分析，结果（表5）表明，各氨基酸间相关性较强，且大多相关系数均大于0.70，说明氨基酸积累间存在显著的协同关系。除Met与Asp、Ser、Arg、Tyr、Phe、Ile、Pro及Pro与Cys和Ile间相关性不显著外，其余氨基酸含量间均存在显著或极显著正相关关系（＜0.01），未见负相关，表明氨基酸间正相关性较强。

图1 顶坛花椒不同季节萌发枝条的果皮氨基酸积累量Fig.1 Amino acid accumulation in pericarp of germinating branches of Z.planispinum var.dingtanensis in different seasons

表3 顶坛花椒不同季节萌发枝条的果皮风味氨基酸含量阈值比Table 3 Threshold ratio of flavor amino acid content in pericarp of germinating branches of Z.planispinum var.dingtanensis in different seasons

表4 顶坛花椒不同季节萌发枝条的果皮特殊功效氨基酸积累量Table 4 Special effective amino acid accumulation in the pericarp of germinating branches of Z.planispinum var.dingtanensis in different seasons

2.4 顶坛花椒不同季节萌发枝条的果皮氨基酸营养价值评价

2.4.1 氨基酸营养价值分析 食品的必需氨基酸模式越接近人体蛋白模式，机体对其利用率越高，营养价值就越高。由表6可知，不同季节萌发枝梢挂果果皮Met+Cys和Phe+Tyr含量相对不足；此外，秋梢中Ile表现出相同规律，且为第一限制氨基酸，发现春梢和夏梢最接近模式谱。SRC值大小为春梢＞夏梢＞秋梢，其中，春梢相对接近模式谱，可见其必需氨基酸组成更加合理，营养价值更高，其次为夏梢。

2.4.2 主成分分析由表7可知，2个主成分对应的特征值大于1.000，累积方差贡献率为95.129%，故选前2个主成分，可反映不同处理顶坛花椒果皮氨基酸的大部分信息，能表征氨基酸质量。第1主成分（PC1）方差贡献率为89.282%，对花椒果皮风味品质的影响最大，其中，除Met、Ile和Pro外，其余氨基酸的载荷值均大于0.900，为高度相关；第2主成分（PC2）的方差贡献率为5.847%说明其对花椒果皮风味品质有一定影响，其中，Met有较大的正向影响，Pro有负向影响（表8）。

2.4.3 综合评价进一步，根据表8的数值，利用PCA分析的前2个主成分的分值和代替17种氨基酸对花椒果皮氨基酸质量进行分析，得到其线性关系分别为：

2个主成分综合反映了不同枝条萌发季节顶坛花椒果皮氨基酸的总体水平，单独使用一个不能对3处理的氨基酸质量做出综合评价，因此以各主成分的方差贡献率为权重。对2个主成分得分加权求和，建立综合评价函数=0.893+0.058，计算春梢、夏梢和秋梢的综合评价分值，总得分反映花椒果皮氨基酸综合质量。由表9可知，2个主成分综合得分大小表现为春梢＞夏梢＞秋梢，与必需氨基酸营养评分排序一致，因此，春梢发育的顶坛花椒果皮营养品质最高，夏梢次之，秋梢最差。

表5 顶坛花椒不同季节萌发枝条的果皮氨基酸指标间相关分析Table 5 Correlation analysis of pericarp amino acid indexes of germinating branches of Z.planispinum var.dintanensis in different seasons

表6 顶坛花椒不同季节萌发枝条的果皮必需氨基酸营养价值评分Table 6 Nutritional value score of essential amino acid in pericarp of germinating branches of Z.planispinum var.dingtanensis in different seasons

表7 主成分的特征值和贡献率Table 7 Eigenvalues and contribution rates of principal components

表8 主成分的特征向量与载荷矩阵Table 8 Eigenvectors and load matrices of principal components

表9 顶坛花椒不同季节萌发枝条的果皮氨基酸成分得分与综合评价Table 9 Score and comprehensive evaluation of amino acid composition in pericarp of germinating branches of Z.planispinum var.dingtanensis in different seasons

3 讨论

3.1 枝条萌发季节对顶坛花椒果皮氨基酸含量及组成的影响

大量研究表明，植物品种（刘伟等，2019）、产地（李治平等，2020）和树体管理方式（殷丽琼等，2019；刘丙花等，2021）等均影响果实品质；本研究发现，枝条萌发季节也会影响顶坛花椒果皮氨基酸品质的形成，春梢和夏梢的氨基酸积累量高于秋梢，原因是处理间枝条发育时间差异较大，积累时间长短与氨基酸变化趋势一致，春梢相对夏梢和秋梢有更长的积累时间，利于营养物质积累；其次，研究区的光、温、水等环境因子的季节分布不均，春季降水、光照和温度等条件温和，氮代谢加快，促进了枝条营养贮存蛋白合成与积累，而夏季和秋季的碳代谢加快、氮素利用效率下降、土壤速效氮含量降低（唐海龙等，2019；黄振格等，2020），抑制了营养贮存蛋白的合成与积累，加之不同季节萌发枝条的冠层性质存在差异，秋梢发育的冠层较春梢和夏梢冠层性质差，造成树冠小气候的差异（Lewallen and Marini，2003；Anthony et al.，2020），进而影响了其氨基酸积累。本研究检测出不同季节萌发的顶坛花椒枝条结实中，均含有17种氨基酸，TAA含量介于5.52～7.45 mg/g，其中Glu含量最高，与侯娜等（2017）在其他花椒品种中测得的氨基酸种类及含量基本一致，这可能与花椒遗传性状较为稳定有关。此外，本研究中发现顶坛花椒秋梢结实Ile含量较春梢和夏梢显著减少，表明Ile含量对季节变化较敏感，推测可能是秋季的温度和水分等条件不适宜，抑制了秋梢Ile相关合成酶的合成，导致其含量降低，但具体原因有待进一步研究。

3.2 顶坛花椒果皮氨基酸积累量及风味对枝条萌发季节的响应

不同树形、遮荫及嫁接等树体管理方式与植物果实氨基酸的积累量有关（刘建军等，2013），例如核桃中主干分层形的氨基酸积累量较多（刘丙花等，2021）；短期遮荫能增加茶树氨基酸积累量（顾辰辰等，2017）。本研究结果总体上表明秋梢挂果的果皮氨基酸积累量较春梢和夏梢低，与引起不同季节萌发枝梢氨基酸含量差异的形成机理相近。由此推断枝条萌发季节也会影响果皮氨基酸积累，这为生产上进行留梢管理打下了理论基础。

MAA是人体不能合成的氨基酸，却是维持机体氮平衡所必需（张晓煜等，2004）；Glu可与人体内的血氨结合，形成对人体无害的谷氨酰胺，解除组织代谢过程中产生的氨毒害；Asp具有预防心脏病、高血压、肝病、糖尿病等疾病的作用（姜仲茂等，2016）；支/芳比高的食物对肝患者恢复有积极作用（Kano et al.，1991）。本研究结果显示，秋梢发育顶坛花椒果皮的MAA/TAA最大，为59.33%，高于药用植物龙州金花茶的55.86%（李先民等，2020），其中Glu、Leu和Asp含量较高，占MAA的50%以上，支/芳比为3.18～4.07，比值大小表现为春梢＞夏梢＞秋梢，能满足肝损伤患者的需求。因此枝条萌发季节对其药用价值有一定影响，这为定向培育提供了思路。由于顶坛花椒为药食同源植物，其分解代谢产生的次生物质，既是品质指标，也是药用资源，未来加强留梢与这些物质积累的相关研究，具有重要实践意义。

麻味素对花椒麻味的贡献较大，Val和Leu被认为是合成麻味素含氮部分的前体物质（Greger，2016）。本研究中，Val和Leu随枝条萌发季节变化而降低，秋梢结实的麻味较春梢和夏梢可能下降；不同季节萌发枝条中顶坛花椒果皮中风味氨基酸含量丰富，其中SAA占TAA的46.14%～50.37%；从RCT值看，Asp对花椒风味影响最大，其次为Glu、Arg、Cys和His，His仅在春梢和夏梢中对花椒风味影响较大，表明这4种氨基酸是形成花椒独特风味的原因之一，而秋梢的Asp、Glu和Cys含量低于春梢和夏梢。综上，推断花椒秋梢挂果的香麻味有所下降，春梢和夏梢花椒果实风味偏高，更加适合用作调味品加工。

3.3 枝条萌发季节对顶坛花椒营养价值评分的影响

氨基酸比值系数法是评价食物蛋白营养价值的常用方法，根据氨基酸平衡理论利用FAO/WHO的氨基酸模式进行蛋白质质量评价。本研究中，春梢挂果的果皮氨基酸营养与FAO/WHO规定的人体所需理想蛋白质最接近，夏梢次之；3个不同枝条萌发季节处理挂果的Met+Cys和Phe+Tyr含量相对不足，而秋梢的Ile为第一限制氨基酸。造成以上结果的原因可能是，季节的光照、温度和水分等变异较大，影响了顶坛花椒氮代谢速率，秋梢生长发育时间最短，致使其次生代谢物质的积累减少，引起果实品质下降。

本研究结果显示，春梢和夏梢的SRC分别为66.08和63.65，均高于无籽刺梨59.22（鲁敏等，2015）、蒲桃56.38（王齐等，2012）、覆盆子54.03（陈晓燕等，2012），秋梢的SRC为52.08，低于无籽刺梨、蒲桃和覆盆子。通过PCA分析发现顶坛花椒不同季节萌发枝梢果皮氨基酸品质差异较大，排序依次为春梢＞夏梢＞秋梢，可能是由于秋梢中Ile含量的显著降低，影响了整体的营养价值，但其机理有待进一步研究。因此，花椒果皮的产品可与牛奶、鸡蛋等动物蛋白相结合，提高花椒的食用价值。本研究中，春梢和夏梢更利于花椒氨基酸品质的形成，因此可在秋梢萌发前对其进行补充氮素，增加植物氨基酸的次生代谢物积累，改善秋梢挂果品质。

综上所述，春梢的营养价值更高，夏梢次之；由于春梢萌发骨干枝管理上的难度大，结合氨基酸积累特征和枝条修剪、树形培养等难易程度，实际生产中可倾向选择夏季末期萌发枝条作为骨干枝，培育氨基酸品质更高的花椒果实；此外，因春梢为3月萌发，次年6月收获，影响花椒收获周期，故建议在生产活动中可与夏梢进行交错留枝，实现花椒稳产稳质。鉴于果实品质为综合因子，受维生素C、蛋白质和可溶性固形物等影响，未来有待结合上述品质指标深入开展研究。

4 结论

受枝条萌发季节影响，顶坛花椒果皮氨基酸种类、含量与组成存在一定差异。综合营养与药用价值及主成分分析结果，并兼顾管理的便利性可得，夏季萌发枝条适宜培育为骨干枝，可提高顶坛花椒果实的氨基酸品质。