黄芪甲甙对急性心肌梗死大鼠心室重构和NOX/ROS/TNF-α信号通路的影响

赵佩，邹青，李泽霖

空军军医大学第二附属医院心血管内科，西安710038

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由于冠状动脉供血突然严重减少或中断，使心肌严重急性缺血进而产生缺血性坏死的心血管系统疾病。近年来，虽然全球AMI死亡率和发病率持续下降，但后续死亡率较一般人群高30%［1］，表明AMI对人类生命安全仍具有较大威胁。患者在AMI后心室形态结构发生的变化称为心室重构，表现为心肌梗死区域变薄，而非梗死区域心肌肥厚，使心室腔逐渐扩大，是导致心力衰竭的主要原因［2］，因此延迟或防止心室重构是预防心力衰竭的关键。有研究者认为，中成药在改善AMI心室重构方面具有明显优势［3-4］。黄芪甲甙主要来源于中药黄芪生物皂苷的提取物，具有广泛的药理学作用，包括抗肿瘤、抗炎、抑制上皮间质转化和内质网应激等［5-8］。王皓等［9］发现黄芪甲苷可通过激活一氧化氮合酶信号通路，抑制炎性因子生成，对AMI模型大鼠具有保护作用，也有研究表明，黄芪甲甙可抑制心室重构，改善心功能，降低慢性心力衰竭大鼠游离脂肪酸水平［10］。然而黄芪甲甙对AMI后心室重构的潜在机制有待进一步阐明，因此本研究通过建立AMI大鼠模型进行黄芪甲甙处理并进一步探究其作用机制，以期为AMI的治疗研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar雄性大鼠36只，SPF级，6～7周龄，体质量226～250 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。

1.2 试剂

黄芪甲甙（纯度≥98%）购于北京索莱宝公司；阿司匹林肠溶片（国药准字H20065051）购于沈阳奥吉娜药业有限公司；血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）、内皮素1（endothelin-1，ET-1）、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）大鼠酶联免疫吸附检测试剂盒均购于上海江莱生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；Trizol购于默克公司；实时荧光定量PCR引物购于生工生物工程（上海）股份有限公司；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均购于大连宝日生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、造模及药物干预 造模前大鼠适应性喂养1周，随机分为假手术组、模型组、黄芪甲甙低剂量组、黄芪甲甙中剂量组、黄芪甲甙高剂量组和阳性对照组共6组，每组6只。除假手术组大鼠外，其他5组大鼠按荣霞等［11］的方法建立急性心肌梗死大鼠模型，用10%水合氯醛麻醉大鼠，连接683呼吸机和SurgiVet V3404+心电图机（中国香港友诚生物科技有限公司），结扎冠状动脉左前降支，待左心室部分心肌变白且收缩逐渐减弱后，将心脏放回胸腔并排出胸腔气体后缝合，心电图出现Ⅱ导联ST段抬高表示造模成功，假手术组大鼠开胸后仅分离冠状动脉左前降支，不做结扎处理；之后逐层缝合。造模后第2天开始药物干预：黄芪甲甙低剂量组给予20 mg·kg-1黄芪甲甙灌胃处理；黄芪甲甙中剂量组给予40 mg·kg-1黄芪甲甙灌胃处理；黄芪甲甙高剂量组给予60 mg·kg-1黄芪甲甙灌胃处理；阳性对照组给予100 mg·kg-1阿司匹林灌胃处理［12］；假手术组和模型组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃处理，各组大鼠均持续干预4周。末次干预1 h后，各组大鼠均进行超声心动图检查和血流动力学指标检测，再取腹主动脉血5 mL，L535-1离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）3 000 r·min-1离心15 min，收集血清，处死大鼠后取心脏，0.9%氯化钠溶液清洗表面，取部分样本制备单细胞悬液用于活性氧检测，另一部分样本液氮速冻，血清和心脏均保存于-80℃冰箱。

1.2.2 大鼠心功能检测 比较治疗第0、2、4周各组大鼠心功能变化，采用大小鼠超声影像系统（玉研仪器，Sigma Vet）检测心功能指标，包括左心室射血分数（left ventricular ejection fractions，LVEF）、左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。检测血流动力学指标后，迅速处死大鼠，开胸摘取心脏计算左心室质量指数（left ventricular mass index，LVMI）。

1.2.3 血流动力学指标检测 各组大鼠在进行末次超声心动图检测后，左心室连接压力传感器，并用心脏血流动力学监测系统（成都泰盟软件有限公司，型号：BL-420N）检测血流动力参数左心室舒张末压（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）和左室内压最大上升/下降速率（±dp/dtmax）。

1.2.4 大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平检测 采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平，将稀释抗体添加至96孔板中，再加入稀释后的血清样品，37℃孵育1 h，加入酶标抗体，37℃孵育1 h，洗板，加入3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）底物溶液，37℃孵育30 min后终止反应，于酶标仪上以450 nm波长读取OD值。

1.2.5 检测心肌组织活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量 采用酶消化法制备大鼠心肌单细胞悬液（1×106个·mL-1），用稀释后的荧光染料重悬细胞沉淀，37℃孵育1 h后，离心收集细胞沉淀，磷酸缓冲液（phosphoric acid buffer，PBS清洗并重悬，采用930F荧光分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）检测，激发波长为502 nm，发射波长为530 nm。

1.2.6 检测心肌组织NADPH氧化酶（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）mRNA相对表达量 采用Trizol法提取大鼠心肌组织总核糖核酸，并用紫外分光光度计确定浓度和纯度，按逆转录试剂盒说明书配置逆转录反应体系，将核糖核酸逆转录为互补脱氧核糖核酸，并按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书配置PCR反应体系，在PCR仪（Biorad，型号：CFX96）上进行扩增，PCR反应程序：95℃1 min；95℃5 s，60℃30 s，循环40次；72℃延伸1 min。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算NOX和TNFα mRNA的相对表达量，所有操作均在超净台上进行，引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7 检测心肌组织NOX和TNF-α蛋白表达水平将大鼠心肌组织充分匀浆、冰上裂解后提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。采用Western blot检测心肌组织NOX和TNF-α蛋白表达水平，配置电泳凝胶，电泳至蓝色染料标记到达凝胶末端，采用聚偏氟乙烯膜进行电转，5%脱脂牛奶中封闭1.5 h，缓冲液洗膜15 min，4℃孵育一抗过夜，缓冲液洗膜15 min，室温孵育二抗2 h，缓冲液洗膜15 min，显色后在凝胶成像系统中拍摄照片，并采用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，柱状图制作采用Graphpad Prism 6.0软件，计量资料采用平均值±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 黄芪甲甙对急性心肌梗死大鼠心功能指标的影响

由表2可知，随着治疗时间的增加，黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组和阳性对照组LVEF、LVFS水平呈逐渐升高的趋势（P＜0.05），但假手术组、模型组和黄芪甲苷低剂量组LVEF、LVFS水平差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗第0、2、4周，与假手术组比较，模型组LVEF、LVFS水平均显著降低（P＜0.05）。治疗第0周，与模型组比较，黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组和阳性对照组LVEF、LVFS水平差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗第2周，黄芪甲苷高剂量组LVEF、LVFS水平均显著升高（P＜0.05），黄芪甲苷低剂量组、中剂量组与阳性对照组LVEF、LVFS水平差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗第4周，与模型组比较，黄芪甲苷高剂量组和阳性对照组LVEF、LVFS水平均显著升高（P＜0.05），黄芪甲苷中低剂量组LVEF、LVFS水平差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗第4周，与假手术组比较，模型组LVMI水平显著升高（P＜0.05）；治疗第4周，与模型组比较，黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组和阳性对照组LVMI水平均显著降低（P＜0.05），但与黄芪甲苷低剂量组LVMI水平差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，黄芪甲苷能改善AMI大鼠心脏射血功能和收缩功能，减轻左心室肥厚，改善心室重构，且高剂量改善效果最优。

表2 黄芪甲甙对急性心肌梗死大鼠心功能指标影响（±s）Table 2 Effects of AstragalosideⅣon cardiac function indicators in rats with acute myocardial infarction(±s)

表2 黄芪甲甙对急性心肌梗死大鼠心功能指标影响（±s）Table 2 Effects of AstragalosideⅣon cardiac function indicators in rats with acute myocardial infarction(±s)

注：LVEF—左心室射血分数；LVFS—左心室短轴缩短率；LVMI—左心室质量指数。※表示第2周与同组治疗第0周比较，差异在P＜0.05水平有统计学意义；△表示第4周与同组治疗第2周比较，差异在P＜0.05水平有统计学意义；*表示与相同治疗时间假手术组比较，差异在P＜0.05水平有统计学意义；#表示与相同治疗时间模型组比较，差异在P＜0.05水平有统计学意义。

组别（n=6）假手术组模型组黄芪甲苷低剂量组黄芪甲苷中剂量组黄芪甲苷高剂量组阳性对照组治疗时间/周0 2 4 0 2 4 0 2 4 0 2 4 0 2 4 0 2 4 LVEF/%83.48±3.22 81.54±2.41 82.96±2.21 68.52±1.48*69.85±1.29*70.17±1.30*68.73±1.32*69.81±1.14 70.68±1.65 68.48±1.40 71.65±2.13※75.42±1.79△#69.01±1.59*73.16±1.63※#79.74±1.68△#68.54±1.46 71.58±2.12※75.84±1.48△#LVFS/%35.15±4.41 34.68±3.47 35.02±3.42 23.82±3.29*23.77±3.75*23.67±2.52*23.07±2.12 26.79±2.58 27.63±2.26 23.85±2.97 30.14±3.28※#34.31±2.59△#23.94±4.13 29.55±3.51※#36.08±2.98△#23.28±2.47 29.39±2.62※#33.72±1.43△#LVMI/（g·m-2）— —92.37±6.78— —174.92±9.37*— —168.44±10.82— —108.42±9.64#— —99.28±8.21#— —112.69±9.26#

2.2 黄芪甲甙对急性心肌梗死大鼠血流动力学指标的影响

由图1可知，与假手术组比较，模型组大鼠血流动力学指标LVSP、±dp/dt均显著降低（P＜0.05），LVEDP显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组和阳性对照组LVSP、±dp/dt均显著升高（P＜0.05），LVEDP显著降低（P＜0.05），但与黄芪甲苷低剂量组LVSP、LVEDP、±dp/dt差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，黄芪甲苷可增强AMI大鼠心室的收缩和舒张功能，改善血流动力学指标，中、高剂量均有较好的疗效。

图1 黄芪甲甙对急性心肌梗死大鼠血流动力学指标的影响Fig.1 Effects of AstragalosideⅣon hemodynamic indicators in rats with acute myocardial infarction

2.3 黄芪甲甙对急性心肌梗死大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平的影响

由图2可知，与假手术组比较，模型组大鼠血清AngII、ET-1、BNP均升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组和阳性对照组血清AngII、ET-1、BNP均降低（P＜0.05），黄芪甲苷低剂量组变化无统计学意义（P＞0.05）。结果说明，黄芪甲苷可通过降低血清AngII、ET-1和BNP水平，促进血管收缩，进而增加回心血量，减少心室负荷，抑制AMI后代偿性心室重构，高剂量效果最优。

图2 黄芪甲甙对急性心肌梗死大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平的影响Fig.2 Effects of AstragalosideⅣon levels of serum AngⅡ,ET-1 and BNP in rats with acute myocardial infarction

2.4 黄芪甲甙对急性心肌梗死大鼠心肌组织ROS含量的影响

由图3可知，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织ROS含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组和阳性对照组心肌组织ROS含量显著降低（P＜0.05），但与黄芪甲苷低剂量组的ROS含量差异无统计学意义（P＞0.05）。结果说明，中、高剂量的黄芪甲苷能降低AMI大鼠心肌组织ROS含量，从而减少因ROS过多引起的氧化应激及其对下游靶标的损伤。

图3 黄芪甲甙对急性心肌梗死大鼠心肌组织ROS含量的影响Fig.3 Effects of AstragalosideⅣon ROS content in myocardial tissue of rats with acute myocardial infarction

2.5 黄芪甲甙对急性心肌梗死大鼠心肌组织NOX、TNF-α表达的影响

由图4可知，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织NOX、TNF-α mRNA相对表达量和蛋白表达水平均升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组和阳性对照组心肌组织NOX、TNF-α mRNA相对表达量和蛋白表达水平均降低（P＜0.05），但与黄芪甲苷低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明黄芪甲苷可抑制AMI大鼠心肌NOX、TNF-α表达。

图4 黄芪甲甙对急性心肌梗死大鼠心肌组织NOX、TNF-α基因和蛋白表达水平的影响Fig.4 Effects of AstragalosideⅣon gene and protein expression levels of NOX and TNF-α in myocardial tissue of rats with acute myocardial infarction

3 讨论

AMI临床表现为心前区或胸骨后的压榨性疼痛，可伴有恶心、呕吐、呼吸困难等症状［13］，严重影响患者的生存期和生活质量。心室重构是AMI重要病理特征，包括心室壁增厚、心室扩张和胶原纤维增生，导致心功能障碍、耗氧量增加，严重时甚至会引发心源性死亡［14］。因此抑制心室重构是治疗AMI的关键步骤。目前对AMI引起的心室重构作用机制尚不明确，通过建立AMI模型大鼠对其进行进一步研究具有重要的临床意义。

黄芪具有补气升阳、固表止汗、生津养血、行滞通痹等作用［15］；同时黄芪制剂对心脏有保护作用，包括促进心脏微血管形成、改善心肌细胞肥大、抑制心肌细胞凋亡和炎症损伤、减轻氧化应激、改善能量代谢紊乱等［16］，黄芪甲甙作为黄芪的重要活性成分也具有相似的作用［17］。本研究结果表明，黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组和阳性对照组AMI大鼠心功能指标LVEF、LVFS随治疗时间的增加不断改善，且改善程度均优于模型组，同时LVMI和血流动力学指标LVSP、LVEDP、±dp/dt均有显著改善，表明黄芪甲甙可改善AMI大鼠心室收缩功能和左心室肥厚状态，抑制AMI后心室重构，可能与黄芪甲苷抑制炎症反应和改善心肌细胞肥大的作用相关。

AngⅡ、ET-1、BNP水平与心室重构密切相关。AngII可加重心脏纤维化，诱导心室重构，同时伴随氧化应激反应和炎症反应［18］。ET-1是心血管最主要的血管收缩剂，参与内皮功能障碍和炎症的发生发展，以及血管重塑过程，心肌组织中ET水平上调会导致心肌纤维化以及心室收缩和舒张功能障碍，且内皮素拮抗剂可改善心肌纤维化和心室重构［19-20］。研究表明，连续3个月BNP水平下降率是左心室重构的重要独立预测因子［21］。本研究发现经中、高剂量黄芪甲甙干预后，AMI大鼠血清AngⅡ、ET-1、BNP水平均降低，佐证了黄芪甲甙对AMI后心室重构的抑制作用。

NOX是ROS的主要来源之一，Zhang等［22］发现AngⅡ可以激活NOX，增加其蛋白质表达和催化活性，促进ROS的产生。ROS通过多种途径导致细胞损伤，包括促炎信号通路的激活、抗氧化剂和信号分子的消耗以及大分子的氧化［23］。TNF-α可能是心脏损伤、炎症和细胞凋亡发病机制中的重要细胞因子，通过激活TNF受体介导的多种信号分子诱导多种炎症基因表达［24］。研究表明，脑心通胶囊可通过肝X受体α抑制NOX/ROS/TNF-α信号传导通路改善AMI后心室重构［25］，与本研究结果基本一致，说明黄芪甲苷对AMI的治疗作用可能与调控NOX/ROS/TNF-α信号通路相关。

综上所述，黄芪甲甙对AMI大鼠心功能及血流动力学有明显改善效果，且可降低其血清AngⅡ、ET-1、BNP水平，抑制心室重构，可能与下调NOX/ROS/TNF-α信号通路表达有关，但具体作用机制还需后续实验进一步研究。