橡胶草TkAPC10基因的鉴定及其表达模式分析

覃 碧 王肖肖，2 杨玉双 聂秋海 陈秋惠 刘实忠*

（1. 中国热带农业科学院橡胶研究所，海口 571101；2. 海南大学热带作物学院，海口 570228；3. 北京玲珑蒲公英科技发展有限公司，北京 110000）

泛素—蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system）是一个高效、专一性和选择性强的蛋白降解系统，由泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）、泛素连接酶（E3）和26S 蛋白酶体组成，其中E3 决定泛素化底物的特异性。泛素化过程中，E1 负责激活泛素蛋白（Ub），并把激活的Ub 连接到E2 上，形成E2-Ub 复合物。E3 负责识别目标蛋白，促进E2将Ub 转移到靶蛋白上。泛素化修饰的蛋白可被26S 蛋白酶体降解成短肽和氨基酸释放到细胞中可供再次利用。泛素—蛋白酶体途径在植物生长发育、激素合成、感知和下游信号传导、自交不亲和、抗病、抗逆、表观遗传、形态建成等过程都发挥重要作用。

在拟南芥基因组中有超过1 600 个基因编码泛素—蛋白酶体系统的核心组分，占到其蛋白质组的近6%，其中包含2 个E1，至少37 个E2，而E3 则 超 过1 400 个。APC/C（anaphase-promoting complex/cyclosome）是一个泛素连接酶E3复合体，研究人员从遗传学、生物化学以及结构生物学的角度揭示APC/C 的组成与结构模型，结果表明，该复合体由13个不同的亚基组成，包括核心亚基和激活调节亚基。核心亚基由APC1、APC2、APC3/CDC27、APC4、APC5、APC6/CDC16、APC8/CDC23、APC9、APC10/DOC1、APC11，其 中APC3/CDC27、APC6/CDC16、APC8/CDC23 分别含有2 个拷贝，这3 个蛋白形成的二聚体组成一个四肽重复TPR 子复合体；APC2 与APC11 形成一个催化中心子复合体；APC1、APC4 和APC5 组成一个结构性骨架，该骨架连接TPR 和催化中心子复合体，末端的APC3/CDC27 与APC10/DOC1 及激活蛋白CDH1 或 者CDC20 结 合。APC10/DOC1 和CDC20 或CDH1 决定APC/C 复合体识别底物的特异性及其活性，并负责将泛素连接到底物蛋白上。APC/C 复合体主要通过调控细胞周期过程从而调控有机体的正常生长和发育。在酵母中，提高APC10 的表达水平可延长酵母细胞的寿命，在人类细胞中APC10 蛋白活性的提高或者降低均与癌症有关。在植物拟南芥中，调控叶片和导管的发育，过 表 达导致植株出现类似乙烯和生长素敏感的表型，表明参与乙烯和生长素信号调控植物生长发育的过程。在水稻中，OsAPC10 与TAD1 形成复合体对MOC1 进行泛素化修饰和降解从而调控水稻的株高和分蘖。由于APC/C 复合体结构及功能的复杂性，非模式植物中有关APC/C复合体的编码基因及其功能知之甚少。

橡胶草（Rodin）为菊科（Asteraceae）蒲公英属（）植物，其根部的乳管细胞可合成优质的天然橡胶，是极具发展前景的产胶作物，也是研究天然橡胶生物合成的理想模型。尽管泛素连接酶在其他植物中的重要功能已经得到证实，但目前尚未有橡胶草泛素连接酶基因克隆及其功能研究的报道。为揭示泛素连接酶基因在橡胶草生长发育、天然橡胶合成以及逆境响应中的功能，克隆了橡胶草基因，并分析其基因与蛋白结构特征及基因表达模式，为橡胶草遗传改良提供优异基因资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料为本实验室保存的橡胶草种质1 151，于人工气候箱内培养，培养温度23℃，光照16 h·d，光照强度为2 000～2 500 lx。在盛花期同时取不同组织（包括根、叶、花和花梗），用于分析基因在不同组织的表达特征。采用不同胁迫（包括PEG6000、甘露醇、NaCl）以及不同激素（包括脱落酸、乙烯利、茉莉酸甲酯）对2～3 个月龄的组培苗进行处理，具体处理方法参照本实验室前期建立的方法进行，在处理后不同时间分别取其叶片，用于分析基因的表达模式。

1.2 实验方法

橡胶草叶片基因组DNA采用高效植物基因组DNA 提取试剂盒（TIANGEN）提取，不同组织的总RNA 采用多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒（TIANGEN）提取，提取步骤参照试剂盒说明书进行。采用微量分光光度计（P-330-31-10，Implen）检测DNA 与总RNA 的浓度与纯度。以1 μg 的总RNA 为模板，采用反转录试剂盒（Vazyme）合成得到cDNA，具体步骤参照说明书进行。

用拟南芥AtAPC10（登录号：NP_565433.1）的氨基酸序列对橡胶草基因组序列进行tBlastn 搜索，获得橡胶草基因的DNA 序列，并设计基因克隆引物TkAPC10-F和TkAPC10-R（见表1），用KOD 高保真性聚合酶（TOYOBO）进行PCR 扩增，反应体系：cDNA 模板2 μL（～60 ng），2×PCR buffer for KOD FX 25 μL，dNTPs 10 μL，上、下游引物（10 μmol·L）各1 μL，KOD FX 1 μL，ddHO 补足50 μL，扩增程序为94℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，68 ℃延伸1 min，共33个循环；最后4 ℃保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳后，目的片段采用凝胶回收试剂盒（OMEGA）进行回收，并连接到平末端克隆载体Blunt-Zero（Vazyme）上转化大肠杆菌DH5α 进行克隆，菌落PCR 检测后挑取阳性单克隆送测序公司进行测序验证。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences used in this study

根据基因cDNA 序列设计荧光定量qRT-PCR 引物TkAPC10-QF 和TkAPC10-QR（见表1），以橡胶草基因作为内参基因，采用SYBR Green 法进行qRT-PCR 扩增，反应体系为2×SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）10 μL，上、下游引物（10 μmol·L）各0.4 μL，cDNA 1 μL（30 ng），ddHO 8.2 μL，在荧光定量PCR仪（CFX96，Bio-Rad）上进行扩增，扩增程序为95℃预变性30 s；95℃变性10 s，60℃退火30 s，共40个循环。根据CT 值用2计算目的基因的相对表达量。采用SAS 软件进行单因素ANOVA 完全随机（均衡）分析差异显著性，采用Origin Pro 2019软件进行作图。

采用NCBI 的ORF Fider 分析工具确定基因的ORF 及其编码氨基酸序列，采用Cell-PLoc 2.0 软件预测蛋白的亚细胞定位情况。采用SMART 分析工具对TkAPC10 的蛋白结构特征进行分析。通过搜索橡胶草基因组，提取基因起始密码子前的2 000 bp 作为启动子序列，采用PlantCARE 分析工具对其启动子元件进行分析和预测。在NCBI 非冗余蛋白数据库中采用BLASTp 搜索TkAPC10 蛋白序列的同源性序列。采用Clustalx 软件和DNAMAN 软件进行同源蛋白序列比对分析，然后用MEGA7 软件构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 TkAPC10基因的克隆及其剪切方式、蛋白结构特征分析

以橡胶草1151 的cDNA 和基因组DNA 为模板，采用TkAPC10-F和TkAPC10-R引物进行扩增，目标片段经测序验证后获得基因序列，其ORF 为579 bp，编码192 个氨基酸，其基因组DNA 序列为1 092 bp（见图1）。通过对的cDNA 与基因组DNA 序列进行比较，分析其外显子剪切方式，结果如图1 所示，基因包含6 个外显子和5 个内含子，6 个外显子的长度依次为179、61、93、71、105、70 bp（图1，下划线标出），5 个内含子的长度依次为94、132、84、87、116 bp，内含子的边界为5′-GT…AG-3′（图1，用灰色背景标出）。以的cDNA序列在橡胶草基因组中搜索发现，该基因以单拷贝的形式存在。进一步从基因组中提取起始密码子前的2 000 bp 作为启动子序列，采用PlantCARE 软件进行顺式作用元件分析和预测，发现基因的启动子序列上含有ABA 响应的ABRE、茉莉酸响应的CGTCA-motif 和TGACG-motif 元件，以及一些逆境响应相关元件，比如干旱诱导相关的MBS、防御与逆境响应相关的TC-rich repeats、厌氧诱导的ARE元件。

图1 TKAPC10基因序列及其外显子剪切方式外显子用下划线标出；内含子的边界（5′-GT…AG-3′）用灰色背景标出；TkAPC10 基因全长的扩增引物结合位点用双下划线标出，qRTPCR引物的结合位点用蓝色背景标出Fig.1 TKAPC10 gene sequence and its exon splicing patternExons were underlined，the boundaries of introns（5′-GT…AG-3′）were marked with a gray background；the binding sites of primers used in amplification of the full length of TkAPC10 were marked with double underlines，and the binding sites of primers used in qRT-PCR amplification were marked with a blue background

采用不同的生物信息学软件对TkAPC10蛋白的理化性质及其结构特征进行分析发现，TkAPC10 蛋白为21.50 kDa，等电点6.51。采用SMART 在线分析软件以及NCBI 蛋白保守结构域分析发现，TkAPC10 属于APC10 蛋白家族，第27-191 位氨基酸的区域为APC10 保守结构域（见图2），采用TOPCONS 在线分析软件预测，发现该蛋白没有信号肽和跨膜结构域。采用Cell-PLoc 2.0在 线 软 件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi）预测发现，TkAPC10蛋白定位在细胞核中。

图2 TkAPC10蛋白保守结构域分析Fig.2 Analysis of the conserved domain of TkAPC10 protein

2.2 TKAPC10 的同源蛋白搜索及其进化关系分析

以TkAPC10 的氨基酸序列在NCBI 非冗余蛋白数据库中进行BLASTp搜索其同源蛋白，结果表明，不同物种的APC10 蛋白具有很高的同源性，TKAPC10 与莴苣LsAPC10 的相似性最高达到99%，仅有2 个氨基酸差异；与其他菊科植物如刺苞菜蓟CcAPC10、黄花蒿AaAPC10 的相似性也达到95%以上；与木本植物的毛果杨PtAPC10、橡胶树HbAPC10 的相似性达到85%以上；与拟南芥AtAPC10 的相似性为84%；与禾本科植物粳稻OsAPC10 的相似性为74.13%；与人类HsAPC10 的相似性为48.19%，与酿酒酵母ScAPC10（DOC1）的相似性最低，为36%（见图3～4）。进一步的系统进化树分析结果表明，TKAPC10 与双子叶植物的APC10 蛋白聚为一类，而单子叶植物粳稻OsAPC10 单独聚为一类，表明APC10 蛋白在单子叶与双子叶形成之前发生了分化，而人类的HsAPC10、酿酒酵母ScAPC10 也各自聚为一类（见图4）。以上结果表明，不同物种的APC10 蛋白具有较高的保守性，同时在物种进化过程中形成了不同物种间的独特特征。

图3 TKAPC10及其同源蛋白的多重序列比对分析Fig.3 Multiple protein sequence alignment of TKAPC10 and its homologous proteins

图4 TKAPC10与其他物种的APC10蛋白的系统进化关系分析Fig.4 Phylogenetic analysis of TKAPC10 and APC10 proteins from other species

2.3 TKAPC10基因的表达模式分析

采用qRT-PCR 技术对不同组织中基因的表达模式进行分析，发现该基因在花梗中的表达量最低，花和叶中的表达量最高，是花梗中的2.8 倍，其次是根，表明基因在细胞分裂旺盛的组织（花、叶和根）中表达量显著高于细胞分裂活动相对缓慢的组织（花梗）（＜0.05），而在花、叶、根三个组织间的表达量差异不显著（见图5），说明该基因参与橡胶草细胞分裂过程的调控。

图5 TKAPC10基因在橡胶草不同组织中的表达分析各柱形图上用不同字母表示差异显著（P＜0.05），下同Fig.5 Expressions of TKAPC10 in different issues of T.kok-saghyzDifferent letters above each column means significant at P＜0.05 level，the same as below

由于基因启动子含有ABA、JA、干旱等逆境响应元件，因此，利用外源激素ABA、Me-JA、ET 以及PEG6000、甘露醇、NaCl 分别模拟干旱、渗透压、高盐等非生物胁迫对橡胶草进行处理，分析基因对不同激素和胁迫处理的响应情况。结果如图6 所示，外源ABA 处理后，基因转录本显著下降，6 h 的表达水平最低，是对照0 h 的0.5 倍；而外源MeJA 处理后，基因显著上调表达，24 h 达到最高表达量，是0 h 的3.4 倍；外源ET 处理后，基因表达量也显著上升，12 h 达到最高水平，是0 h 的2.6 倍。PEG6000 模拟的干旱胁迫处理后，显著下调表达，48 h 的表达量最低，与对照0 h 相比下调了32%；甘露醇介导的渗透压胁迫处理后，该基因转录水平也显著下降，12 h 的转录水平最低，与对照0 h 相比下降了35%；而NaCl 高盐胁迫处理后，的转录水平显著上调，24 h 达到最大值，是0 h 的3.3 倍（见图6）。以上结果表明，基因参与橡胶草ABA、JA、ET 激素信号传导以及干旱、渗透压、高盐胁迫响应过程的调控。

图6 TKAPC10基因在不同外源激素以及不同非生物胁迫处理下的表达模式分析Fig.6 Expression patterns of TKAPC10 under exogenous hormones and abiotic stress treatments

3 讨论

细胞周期在调控有机体的生长与发育过程中发挥关键作用，是有机体最重要的生物过程之一。真核生物的细胞周期一般分为G1 期、S 期、G2 期和M 期，其中特定调节因子蛋白及时、准确地被降解是确保细胞周期能够单向地、不可逆地向前运转的关键。APC/C 和SCF（Skp1/Cullin/F-box）复合体是 调 控 细 胞周期的两个E3 泛素连接酶。APC/C 复合体介导底物的降解需要激活因子CDH1或者CDC20的激活作用，大部分被识别并降解的底物中均含有D-box 和或KEN-box 结构域。CDH1通过结合APC/C 复合体、识别并招募特定的底物（包括有丝分裂细胞周期蛋白、有丝分裂激酶、参与染色体分离的蛋白质、DNA 复制蛋白质以及转录因子）进而调控细胞周期进程以及基因组的稳定性。

尽管APC/C 复合体的亚基组成和结构模型已经清楚，但各个亚基的功能目前还不是很清楚。在植物中，有关APC/C 复合体的功能研究主要集中在模式植物拟南芥中。对拟南芥不同APC/C 亚基的功能研究结果表明，拟南芥基因编码APC3/CDC27同源蛋白，该基因是调控分生组织的细胞分裂与细胞分化的关键基因，而且基因能够部分互补酵母/突变体的功能，该基因的转录受细胞周期调控，同时将植物细胞周期与细胞分化进程联系起来。拟南芥、的突变均导致植株的育性显著下降，雌配子发生与胚胎发生异常，细胞周期蛋白cyclin B 积累并破坏胚胎形成过程中生长素的分布，而且双基因突变的育性显著低于单基因突变，表明协同在雌配子发生和胚胎发生中发挥关键作用，除此之外，拟南芥能够互补酵母突变体的功能。拟南芥为单拷贝基因，该基因在不同组织中均有表达，而且能够部分互补酵母突变体的功能，AtAPC2 与AtAPC11 及AtAPC8 蛋白互作，突变体导致雌配子发生受损，细胞周期蛋白β-葡萄糖醛酸酶报告蛋白积累，但其四分体时期并没有终止。拟南芥基因编码APC6 同源蛋白，基因突变导致胚囊发育停滞在双核阶段，细胞周期蛋白Cyclin B 无法降解，表明基因在配子体发育过程中具有重要功能。目前研究发现APC/C 的功能主要集中在细胞分裂与细胞分化中的调控作用，而对APC/C 的其他功能知之甚少。研究人员采用细胞周期蛋白作为报告蛋白追踪植株发育过程中APC/C 的活性，发现其E3 泛素连接酶的活性在细胞有丝分裂的后期依然存在，而降低APC/C 活性之后，拟南芥植株出现一些发育异常的现象，包括维管组织，尤其是木质部和木质化的厚壁组织增加，表明APC/C 在植物微管组织发育过程中具有重要功能。进一步研究发现，AtAPC10 蛋白定位在细胞核中，该基因的缺失突变体严重影响雌配子体的发育，AtAPC10 通过调控细胞分裂进而调控叶片和维管束发育；而且基因的过表达导致植株出现类似乙烯和生长素敏感的表型，表明该基因参与乙烯和生长素信号调控植物生长发育的过程。在单子叶植物水稻中，OsAPC10与TAD1形成复合体通过调控MOC1 蛋白进而调控水稻的株高和分蘖；水稻中影响雌配子发育和赤霉素应答，并且参与调控植株的株高，该基因位点的T-DNA 插入突变体中雌配子有丝分裂异常，极核数目减少或者缺失，导致胚乳不能发育，进而造成胚和种子的败育，植株矮化。

为了解析橡胶草APC/C 复合体的功能，本研究克隆了基因，其编码蛋白含有一个保守的APC10 结构域，属于APC10 家族成员。对不同物种的APC10同源蛋白进行系统进化关系分析发现，不同物种的APC10蛋白具有很高的同源性，TKAPC10 与莴苣LsAPC10 的相似性最高达到99%，与拟南芥AtAPC10 的相似性达到84%，蛋白序列的保守性表明不同物种的APC10蛋白具有功能的保守性。以往利用酵母缺失突变体的功能验证结果表明，拟南芥AtAPC10 蛋白能够互补酵母突变体的功能也证明这一结论。系统进化树分析结果表明，双子叶植物与单子叶植物的APC10 聚在不同的亚族，而人类的HsAPC10、酿酒酵母ScAPC10 也各自聚为不同的类群，表明APC10 蛋白在物种进化过程中形成了不同物种间的独特特征，这些特征可能使得不同物种APC10的功能出现分化。采用qRT-PCR技术对的表达模式进行分析，结果表明，在不同组织中均有表达，但在细胞分裂旺盛的组织（花、叶和根）中的表达量显著高于细胞分裂活动相对缓慢的组织（花梗），表明该基因调控橡胶草细胞分裂过程，这与上述APC/C 亚基的功能类似，说明不同物种APC/C 复合体调控细胞周期的保守功能。此外，基因表达受外源激素ABA、MeJA 和ET 以及NaCl 高盐胁迫、PEG6000 模拟的干旱胁迫以及甘露醇介导的渗透压胁迫诱导，表明该基因参与橡胶草激素信号传导以及逆境胁迫响应过程的调控。在干旱条件下，植物的细胞增殖与延展均受到影响，导致叶片变小，同时叶片细胞数量以及细胞大小均下降。细胞增殖阶段受到胁迫时，细胞分裂首先会通过乙烯信号途径降低CDKA 活性从而使细胞周期可逆性地停滞在转录后方式。CDKA是细胞周期的主要驱动力，并且参与细胞周期的G1 到S 以及G2 到M 时期的转变。当胁迫持续存在时，细胞通过退出有丝分裂周期而开始核内复制，从而开始向细胞延展的过渡。而这个过渡过程依赖于GA 信号途径。研究表明，渗透压胁迫影响拟南芥叶片细胞的分裂，改变植株体内GA 代谢，通过抑制子DEL1/E2FE 和UVI4 下调APC/C 的活性从而导致DELLAs蛋白稳定，进而导致有丝分裂提前结束以及细胞提前进入核内复制，而且这个过程与已知细胞周期抑制蛋白的上调无关。基因的功能还有待进一步通过基因过表达、基因敲除的功能互补进行验证，本研究结果为进一步解析基因调控橡胶草细胞分裂、激素信号传导以及逆境胁迫响应过程的功能奠定了良好的基础，为橡胶草遗传改良提供了优异的基因资源。