接种丛枝菌根真菌对模拟大气氮沉降下灌木铁线莲根系形态及养分承载的影响

李赵毅 郝龙飞 刘婷岩 何炎红 张 友 白淑兰* 杨昕瑜

（1. 内蒙古农业大学林学院，呼和浩特 010019；2. 内蒙古自治区林业工作总站，呼和浩特 010020）

土壤氮有效性是气候变化反馈机制的重要因子，近年全球氮沉降量明显增加，严重影响森林生态系统的稳定性。我国已成为最高的氮沉降区域之一。以往的研究表明，过量氮沉降破坏生态系统平衡，如土壤酸化，生物多样性减少，生态系统的碳吸存减弱。丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）在土壤中广泛分布，能与陆地上大部分植物形成菌根共生关系，其通过根外菌丝吸收土壤中的养分，传递给宿主植物，作为交换宿主植物会向菌根真菌供应光合产物，同时菌根共生体可以提高宿主植物对土壤矿质元素的吸收，促进植物生长，提高了植物的抗逆性和抗病性。其中，土壤速效磷是AM真菌丰富度和多样性的最重要驱动因子。桑钰等研究表明，在干旱胁迫下，接种AMF 对疏叶骆驼刺（）混生的多枝柽柳（）幼苗的生长和氮素吸收具有明显的补偿作用，可以帮助多枝柽柳幼苗度过脆弱期，并在一定程度上影响根系形态构建。郑爱珍等研究表明，接种AMF促进番茄（）苗木根系发育，其总根长、表面积、体积、分叉数等指数有显著提高。

植物根系从土壤中吸取养分有2种途径：一是植物根系本身，另一途径则是通过菌根吸收养分。根系形态的变化会直接影响植物氮素吸收效率，对植物生长有着重要的影响。碳（C）、氮（N）、磷（P）是生物有机体的主要组成元素，对植物本身的结构和功能均有重要作用，并参与植物各种生理过程。一般来讲，N 是植物生长的限制性营养元素，而P 在土壤中的含量相对较高，但有效磷的含量较少，大多以不溶性磷酸盐化合物形式存在，以往研究发现AMF 主要影响植物N、P的吸收，对钾（K）的吸收作用甚微。王凯等研究表明，氮沉降提高了榆树（）幼苗体内的C、N 含量，降低了P 含量；刘云龙等研究表明，接种AMF 可以显著提高大豆（）植株对磷素的吸收利用。YU 等研究表明，AMF 群落可以通过调节微生物胞外酶活性和改变红树林根际微环境来影响红树林生态系统中的生物固氮过程，进而提高红树林生态系统的固氮效率。以往研究多为根系形态和植物养分含量对氮沉降和菌根效应单一因素的响应研究，而对二者交互影响的研究相对缺乏。

内蒙古大青山是中国北方重要的生态过渡带，而灌木铁线莲（）是内蒙古生态脆弱、干旱的大青山的主要原生灌木，具有自然植被演替的潜力，分布于阳坡极端干旱并岩石裸露的环境中，本研究团队在以往研究中发现，灌木铁线莲可以与AMF 之间形成了良好的共生关系，这才使它们能够生长在极度干旱的阳坡。因此，本研究以灌木铁线莲为研究对象，在接种AMF 和模拟氮沉降双因素处理下，探讨1年生灌木铁线莲根系形态和各器官养分含量的变化，旨在探讨不同氮沉降水平下，菌根化灌木铁线莲是如何调控植物根系形态构建以应对环境胁迫，最终揭示全球气候变化背景下植物生长策略与生态系统稳定性维持机制。

1 试验材料

灌木铁线莲种子采集于内蒙古呼和浩特市新城区水磨村（40.96°N，111.84°E），将种子用2%的KMnO溶液消毒30 min，然后用去离子水洗净并用于播种。

丛枝菌根真菌为根内根孢囊霉（）和摩西斗管囊霉（）。2 种AMF 菌剂扩繁的寄主植物为紫花苜蓿（），扩繁基质为沙土混合物（沙子和土壤体积比为3∶1），最终的接种菌剂为扩繁基质、侵染根段、孢子和菌丝的混合物，施用的固体菌剂中孢子密度为18.7 个/g土。

2 试验方法

2.1 接菌处理

试验设置4 个处理，分别为单一接种（根内根孢囊霉，简称+R；摩西斗管囊霉，简称+F）、混合接菌（2 种丛枝菌根真菌1∶1 混合接种，简称+RF）和未接菌处理（简称-M）。2019 年10 月，在育苗盆（d=15 cm）底部放入高温高压灭菌扩繁基质至花盆4/5 处（土与蛭石体积比为2∶1），然后在灭菌基质上平铺等量混匀的30.0 g菌剂，未接菌处理中添加等量固体灭菌基质，将消毒后的灌木铁线莲种子播入，再覆盖灭菌基质，每盆质量控制1.0 kg。浇透水后，置于内蒙古农业大学人工气候室培育（温度20～25 ℃，湿度40%～60%，最大光照强度10 000 lx）培养，每盆保留3株幼苗。

2.2 模拟氮沉降处理

2020 年4 月，测定接菌处理苗木菌根侵染率达到60%以上（未接菌处理苗木菌根侵染率为0），开始模拟氮沉降试验。参考全球氮沉降水平和国内外氮添加试验的含量，氮沉降成分主要为活性氮，包括还原态NHx（NH、RNH和NH）和氧化态NOx 两种化学形式。根据试验区氮沉降背景值（3.43 g·m·a），设置4 个氮浓度处理分别为不施氮（CK，0 g·m·a）、低氮（LN，3 g·m·a）、中氮（MN，6 g·m·a）、高氮（HN，9 g·m·a）。用自来水溶解的NHCl 和KNO（NH∶NO为1∶1）作为氮源，隔14 d 每盒施入氮添加溶液150 mL，共施氮10 次。采用喷洒方法将氮均匀施入育苗盆中，各次施入量见表1。4 种接菌处理和4 个梯度氮添加处理，共计16 种处理组合，各处理培育15 盆，每盆3株苗木，共计720株苗木。

表1 模拟氮沉降处理的氮施入量Table 1 Nitrogen addition amount in simulated nitrogen deposition treatment/g

2.3 指标测定

模拟氮沉降处理结束15 d 后，从各处理中随机选取长势较一致的5株苗木，用去离子水清洗根系附着物后，放入FAA 固定液中保存。将FAA 固定液中的根样取出，剪成长度约为1 cm的根段，置于20%的KOH 溶液中，并在水浴锅中90 ℃水浴加热1 h，然后用碱性的HO溶液（10 mL 30% HO，3 mL NH·HO，加蒸馏水至600 mL）软化45 min，再用5%醋酸酸化5 min，5%醋酸墨水（派克墨水）于90 ℃水浴中染色20 min，清水中脱色24 h。将脱色后的根段置于载玻片上制片，用网格十字交叉法进行观察和计数，计算菌根侵染率。孢子密度采用湿筛倾析—蔗糖离心法测定。

模拟氮沉降试验结束15 d 后，从各处理中随机选取长势较一致的1 年生灌木铁线莲幼苗3 株，用去离子水清洗根系附着杂物后，进行根系形态结构的测定。用Epson 数字化扫描仪Expression 10000XL 进行根系形态扫描，并使用根系图像分析软件（Win RHIZO，加拿大Regent）对各处理根系形态进行定量分析，测定直径≤0.5 mm 细根的总根长、总表面积、总体积及根尖数量等形态指标。

根系取样的同期，各处理的植物样品分根、茎、叶3 部分，105 ℃杀青30 min，于70 ℃烘干至恒质量，称量其质量后将样品粉碎，过筛后利用元素分析仪（Elementer VARIO Macro，德国）测定灌木铁线莲苗木的全碳、全氮浓度，采用浓盐酸和浓硝酸按体积比3∶1组成的混合物消煮，采用连续流动分析仪（AA3，美国Technicon）测定苗木的全磷浓度。样品碳、氮和磷含量=碳、氮、磷浓度×生物量。

2.4 数据处理

利用SPSS 23.0（SPSS for Windows，Chicago，USA）对接菌和氮沉降处理进行单因素方差分析和双因素交互作用分析，采用LSD 多重比较法检验各处理苗木细根形态指标和苗木养分含量的差异显著性。采用Sigmaplot 12.5（Systat Software Inc.，San Jose，CA，USA）软件作图。

3 结果与分析

3.1 氮沉降和接菌处理对苗木菌根侵染率和孢子密度的影响

接种菌根真菌和氮沉降处理均显著影响灌木铁线莲苗木菌根侵染率和孢子密度（＜0.01）。-M处理未形成菌根，菌根侵染率和根际土壤孢子密度均为0。3 种接菌处理下，苗木菌根侵染率和根际土壤孢子密度均随着氮浓度的递增呈现先升高后降低的趋势（见表2）。+F 处理下，不同氮沉降处理间菌根侵染率无显著差异，而+R 和+RF 下，LN 处理的苗木菌根侵染率最高，且显著高于其他氮沉降处理；+F、+R和+RF处理，LN处理的根际土孢子密度最大，且显著高于其他氮沉降处理。0N处理下，+R、+RF处理的菌根侵染率和孢子密度无显著差异；LN处理下，+F处理苗木菌根侵染率较+R 和+RF 处理降低了2.6%（＜0.05）和6.1%（＜0.05），孢子密度增加了29.4%（＜0.05）和105.7%（＜0.05）。MN 处理下，+F 处理苗木菌根侵染率较+R和+RF处理增加了9.5%（＜0.05）和4.9%（＞0.05），孢子密度增加了79.7%（＜0.05）和166.9（＜0.05）。HN 处理下，+F 处理苗木菌根侵染率较+R和+RF处理增加了5.7%（＞0.05）和7.0%（＜0.05），孢子密度增加了89.9%（＜0.05）和140.9%（＜0.05）（见表2）。

表2 模拟氮沉降及接菌处理对灌木铁线莲苗木菌根侵染率和孢子密度的影响Table 2 Mycorrhizal colonization rate and spore density of C.fruticosa seedlings under nitrogen deposition and inoculation treatments

3.2 氮沉降和接菌处理对灌木铁线莲苗木细根（直径≤0.5 mm）形态的影响

接种菌根真菌和氮沉降处理均显著影响灌木铁线莲苗木细根形态（＜0.05），且极显著影响灌木铁线莲的总表面积、根尖数量（＜0.001）。-M和+RF 处理下，灌木铁线莲苗木细根（直径≤0.5 mm）的总根长、总表面积、总体积和根尖数量均随氮浓度的递增呈现先上升后下降的趋势；+R 和+F处理下，灌木铁线莲苗木细根（直径≤0.5 mm）各指标均随氮浓度的递增呈现逐渐下降的趋势。-M处理下，直径≤0.5 mm 细根的总根长、总表面积、总体积在不同氮沉降处理间无显著差异，而接菌处理下，直径≤0.5 mm 细根的总根长、总表面积、总体积在氮沉降处理间存在显著差异（见表3）。0N 处理下，-M 处理下苗木细根形态指标显著低于+R和+F 处理。LN 处理下，+F 处理的苗木总根长、总表面积较+R 和+RF 分别显著减少了26.4%、42.3%和23.4%、39.1%。MN 处理下，+F 处理苗木总根长较+R 和+RF 处理减少了39.1%（＜0.05）和60.4%（＜0.05），总表面积减少了37.6%（＜0.05）和57.2%（＜0.05），总体积减少了41.5%（＜0.05）和59.7%（＜0.05），根尖数量减少了31.5%（＜0.05）和66.4%（＜0.05）。HN 处理下，+F 处理苗木根细根形态较+R 和+RF 处理，总根长减少了42.8%（＜0.05）和45.2%（＜0.05），总表面积减少了34.2%（＜0.05）和37.8%（＜0.05），总体积减少了36.7%（＜0.05）和34.1%（＜0.05），根尖数量减少了49.1%（＜0.05）和59.9%（＜0.05）（见表3）。

表3 氮沉降和接菌处理对灌木铁线莲苗木细根（直径≤0.5 mm）形态的影响Table 3 Fine root morphology of C.fruticosa seedlings with a diameter ≤0.5 mm under nitrogen deposition and inoculation treatments

3.3 氮沉降和接菌处理对1年生灌木铁线莲苗木养分含量的影响

氮沉降和接种菌根真菌极显著影响灌木铁线莲苗木碳、氮和磷含量，且显著影响养分含量在苗木各器官中的分配比例。+R 处理下，苗木碳、氮和磷含量随着氮浓度的升高呈增加的趋势（＜0.05）；+F 处理下，苗木氮、磷含量随着氮浓度的升高呈逐渐增大的趋势（＜0.05）。不同氮沉降水平下，-M 处理的苗木体内碳、氮和磷含量高低分布顺序均为叶＞根＞茎，+R、+F 处理的苗木体内碳含量高低顺序为茎＞叶＞根，+R、+F、+RF 处理的苗木体内氮含量高低顺序均为叶＞茎＞根，且在+F 处理下，HN 处理的苗木根、叶内碳、氮、磷含量最高。在0N、LN、MN 和HN 处理下，+F 处理的苗木较-M处理碳含量分别显著增加了178.1%，349.2%，212.3%，504.7%，氮含量增加了86.0%，220.1%，132.1%，501.2%（＜0.05），磷含量显著增加了373.9%，739.6%，533.3%，974.4%（见图1）。

图1 氮沉降和接菌处理对灌木铁线莲苗木养分含量的影响-M.未接菌处理；+R.接种根内根孢囊霉处理；+F.接种摩西斗管囊霉处理；+RF.混合接菌处理；0N.不施氮处理；LN.低氮处理；MN.中氮处理；HN.高氮处理；不同大写字母表示同一接菌处理下，各氮沉降水平间的差异显著（P＜0.05）；不同小写字母表示同一氮沉降水平下，不同接菌处理间的差异显著（P＜0.05）Fig.1 The nutrient content of C.fruticosa seedlings under nitrogen deposition and inoculation treatments-M.Non-inoculation treatment；+R.Inoculated with R.intraradices；+F.Inoculated with F.mosseae；+RF.Mixed inoculation with R.intraradices and F.mosseae；0N.No nitrogen treatment；LN.Low nitrogen treatment；MN.Middle nitrogen deposition；HN.High nitrogen deposition；Different capital lowercase letters indicate significant differences between different nitrogen deposition treatments under the same inoculation treatment（P＜0.05）；Different lowercase letters indicate significant differences between different inoculation treatments under the same nitrogen deposition treatment（P＜0.05）

3.4 苗木细根（直径≤0.5 mm）形态和养分含量相关性分析

接种菌根真菌和氮沉降交互作用影响下，苗木细根（直径≤0.5 mm）形态指标与养分含量指标均呈正相关关系。苗木碳、氮和磷含量与根尖数达到极显著正相关水平（＜0.01），且高于与其他细根形态指标的相关性。苗木磷含量与直径≤0.5 mm 细根的总根长、总表面积、总体积和根尖数量显著正相关（＜0.05），且高于与苗木碳、氮含量与细根形态指标的相关性。直径≤0.5 mm总根长与苗木氮含量也呈显著正相关性（＜0.05）（见表4）。

表4 苗木细根（直径≤0.5 mm）形态和养分含量的相关性Table 4 Correlation analysis of fine root morphology with a diameter of ≤0.5 mm and nutrient content of seedlings

4 讨论

4.1 菌根真菌调控灌木铁线莲菌根侵染率和根际土孢子密度对氮沉降的响应

随着大气氮沉降量增加，导致土壤中氮素含量的变化，进而影响菌根共生体。植物菌根侵染率强度的大小受到土壤中诸多因素影响，其中包括土壤pH，温度和养分等，施氮量显著影响到菌根侵染率。本研究发现3 种接菌处理苗木菌根侵染率随氮沉降增加呈现先上升后下降的趋势。对比不同接菌处理，发现+F 处理的苗木菌根侵染率受氮添加影响最小（＜0.05），表明接种摩西斗管囊霉的苗木对氮胁迫耐受能力较强，这与董泽鹏等研究施氮量对春小麦（）、豌豆（）间作中AMF 侵染率的影响结果一致。同时刘媞等研究不同氮浓度水平下接种AMF 对黄芪（）生理特征的影响也发现，适当氮浓度水平的添加，AMF 可以提高苗木菌根侵染率，但过高的氮浓度会抑制菌根侵染率，也与本研究结果相似。在+R、+RF 处理下，HN 处理苗木菌根侵染率较LN 处理显著降低，可能是HN处理土壤中氨态氮发生硝化作用释放了H，导致了土壤酸化，从而抑制了侵染率。古文超等研究表明接种AM 真菌处理组滇重楼（var）根际土壤中的孢子密度显著增加，这与本研究中3种接菌处理，LN 和MN 处理下的根际土壤中孢子密度变化规律相同，但与HN 处理下的结果相反，原因可能为HN 处理下菌根侵染率下降，孢子密度随之降低。

4.2 菌根真菌调控灌木铁线莲苗木直径≤0.5 mm细根形态对氮沉降的响应

根系形态构型中细根长度、表面积、体积、根尖数量是衡量植物根系分布范围和养分吸收能力的重要指标。苗木养分吸收、分配与根系形态直接相关，根系形态具有可塑性，其可塑性的大小与植物本身的氮素利用率有关。研究发现菌根真菌与宿主植物形成共生体，增强宿主植物吸收水分和养分的能力，提高苗木的抗逆性。本研究中，接菌处理下，灌木铁线莲苗木细根（直径≤0.5 mm）的总根长、总表面积、总体积和根尖数量均较-M 处理下显著增加，但随着氮浓度的增加呈现下降的趋势。荣俊冬等研究表明不同施氮处理改善了福建柏（）幼苗的根系形态；韩勖等研究表明接种真菌明显促进了4种植物狗尾草（）、荩草（）、鬼针草（）、狼杷草（）的根系构建，这与本研究的结果相同。然而，随着氮浓度升高，细根指标下降的原因可能是植物根系形成菌根后，菌根真菌与根系存在碳竞争，也有可能是因为植物的生长策略调节，随着外界氮输入，土壤中有效氮的增加，植物减少了根系生物量的分配，该结果符合植物生长的成本—效益理论。本研究中，+F 处理对细根形态的影响低于其他接菌处理，而菌根侵染率和孢子密度显著高于其他接菌处理，表明接种摩西斗管囊霉提高了植物的耐氮能力。

4.3 菌根真菌调控灌木铁线莲苗木养分含量对氮沉降的响应

丛枝菌根真菌与植物形成菌根共生体后，显著影响植物碳、氮、磷养分吸收。本研究也发现，接菌处理显著影响灌木铁线莲苗木体内养分含量。以往研究表明，土壤中的N 含量是影响菌根真菌生长的重要因子，共生体中的真菌菌丝能将吸收的氮和氨基酸等转化为NH，参与植物氮代谢。本研究结果表明，在MN 处理下，菌根苗苗木体内养分含量最高，并且根、茎、叶养分含量高于氮沉降处理。李海霞等研究表明，白桦（）幼苗根、茎、叶中碳、氮的浓度随着氮素供应量的增加，均呈上升趋势，这与本研究结果有所差异，原因可能是高氮环境中苗木的养分吸收策略，也可能是由于氮沉降量的增加引起土壤酸化，导致根外皮层细胞中大量的酚类物质（如单宁酸）沉淀，加速外层细胞的木质化或栓质化，削弱了根系的吸收能力。辜晓婷等研究表明，接种菌根真菌的大豆体内磷含量显著高于不接菌处理，发现由于菌根真菌侵染活化磷，改善了土壤有效磷。本研究发现，3种接菌处理显著提高了苗木体内养分含量，特别是在+F处理下，苗木体内及各种器官内养分含量达到最大。该结果与张蓓蓓等对小麦籽粒、茎秆在接菌和氮沉降处理下研究结果一致，氮肥施加和接种真菌的综合作用显著提高了籽粒和茎秆养分含量，且在低氮处理下的氮含量最高，但与王艺等对马尾松（）苗木接菌处理研究结果有所差异，其认为外生菌根真菌能显著增加苗木的侧根长、侧根数量，但对马尾松苗木氮素营养的吸收效果不显著。原因可能与不同地区土壤本底氮含量或植物菌根类型差异有关，也有可能是因为两者依赖的菌根类型不同。

5 结论

（1）氮沉降背景下，接种丛枝菌根真菌提高了苗木菌根侵染率和孢子密度，且在接种摩西斗管囊霉处理下菌根共生体的耐氮胁迫能力较强。

（2）接种丛枝菌根真菌可以显著改善苗木细根形态构型，而高氮处理显著削弱了菌根苗吸收根细根形态构建。

（3）接种菌根真菌处理提高了苗木养分含量，增强苗木的耐氮性；且在氮沉降处理下，接种摩西斗管囊霉的苗木养分承载量最大。