胶质瘤中miR-155-5p的表达特征及与凋亡相关因子的相关性

陈 昊

（南阳市第二人民医院神经外科，河南南阳 473000）

胶质瘤起源于神经胶质细胞，在神经外科较为常见，对患者生活质量及生存等影响均较大，近年研究显示其发生率呈升高趋势[1,2]。miRNA是近年发现的与肿瘤形成有关的重要因子[3]，主要通过调控下游靶基因发挥作用[4,5]。我们应用TCGA数据库对胶质瘤中异常表达的miRNAs进行筛选，选择与胶质瘤关联性最强的miR-155-5p进行研究，应用TargetScan数据库行靶向关系预测，选择与凋亡关联性最强的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）和B细胞淋巴瘤蛋白-2（Bcl-2）作为靶基因进行实验。通过前瞻性实验设计，探讨miR-155-5p在胶质瘤中的表达意义，分析其与凋亡因子的关联性。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2016年1月～2017年1月在南阳市第二人民医院确诊为胶质瘤并行手术治疗的47例患者作为研究对象。纳入标准：（1）均有病理诊断，并符合WHO中关于胶质瘤的标准；（2）首次确诊并手术治疗。排除标准：（1）神经系统肿瘤复发患者；（2）术前行针对肿瘤的放、化疗；（3）病理诊断不明确者；（4）近3个月有感染病史及治疗者；（5）伴有免疫系统疾病史。共观察47例，其中男26例，女21例，年龄35～80岁，平均59.61±9.32岁。留取术后新鲜组织（-80℃冻存）和石蜡包埋组织。研究经医院伦理委员会批准通过。

1.2 实验方法

1.2.1 qPCR法检测miR-155-5p 的表达 检测新鲜标本中miR-155-5p的表达，应用实时荧光定量PCR（qPCR）法完成。首先使用TRIzol（美国ABI）提取总RNA，应用逆转录法合成cDNA，引物由上海召远公司合成，其它主要相关试剂购自北京百泰克公司。miR-155-5p引物上游：5＇-AAATATACTGATGCGCGGACGAA-3＇，下游：5＇-TCAAAAAACATACTGGCACCT-3＇。以U6为内参[6]，上游：5＇-GGAACAACCAGAGAAAGATTAGC-3＇下游：5＇-TTGGAATTCACAGAATTCCG-3＇。扩增程序设定：95℃10 min，95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，10个循环；93℃25s，60℃ 35s，72℃ 20s，35个循环后，延伸。60℃采集信号，记录Ct值，以2-ΔΔCt表示结果。

1.2.2 Western blot法检测Caspase-3的表达 基于新鲜标本应用Western blot法检测Caspase-3（为浓缩液，购自北京中杉金桥公司，稀释浓度1：3000）的表达，内参为β-Actin（为浓缩液，购自北京中杉金桥公司，稀释浓度，1：2000）。按实验说明书操作，均由同一技术人员完成。以Caspase-3与β-Actin的比值作为定量结果，应用Image J软件分析。

1.2.3 免疫组织化学法检测Bcl-2的表达 基于石蜡包埋标本检测胶质瘤中Bcl-2的表达，应用免疫组化（二步法）法完成。设阳性对照（滤泡性淋巴瘤的病理组织为阳性对照）。Bcl-2工作液购自北京中杉金桥公司，严格按说明书操作，并由同一技师完成操作。Bcl-2的阳性部位是细胞质和/或细胞膜，选择5个热点区（400倍）进行计数，由病理科医师应用盲法完成，计算阳性率。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0进行分析，两组间比较应用t检验或卡方检验，应用Pearson相关分析及K-M生存分析，以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤不同临床病理特征中miR-155-5p表达的比较

胶质瘤中miR-155-5p表达范围是0.98～1.99，平均1.46±0.42。miR-155-5p在不同肿瘤最大径和不同WHO分级分组的表达中差异有统计学意义（P＜0.05）。而在不同性别、不同年龄分组中的表达差异无统计学意义。见表1、图1。

表1 胶质瘤不同临床病理特征中miR-155-5p表达的比较

图1 miR-155-5p表达的扩增曲线（qPCR法）

2.2 miR-155-5p 与预后的关系

应用电话、门诊或家访的方式对患者术后5年（60月）的生存情况进行随访，截止时间点为2022年1月31日。术后患者生存时间为9～60个月，中位生存时间为45个月。存活26例，死亡19例（其中1例因车祸死亡，计为删失值），失访1例（计为删失值）。K-M生存分析显示miR-155-5p的表达与生存时间相关（χ2=3.64，P=0.024）。见表2、图2。

表2 胶质瘤不同预后患者miR-155-5p表达的比较

图2 miR-155-5p与预后的关系

2.3 miR-155-5p 与Caspase-3的相关性

Western blot法显示Caspase-3表达范围为0.60～3.81，平均2.81±0.41。相关分析显示miR-155-5p 与Caspase-3呈负相关性（r=-0.65，P=0.019）。见图3、4。

图3 胶质瘤中Caspase-3的表达(Western blot法)

图4 miR-155-5p 与Caspase-3的相关性

2.4 miR-155-5p 与Bcl-2的相关性

免疫组化方法显示Bcl-2阳性率范围为1%～80%，平均19.1%。相关分析显示miR-155-5p与Bcl-2呈正相关性（r=0.64，P=0.008）。见图5、6。

图5 胶质瘤中Bcl-2的表达（免疫组化二步法）

图6 miR-155-5p 与Bcl-2的相关性

3 讨论

胶质瘤与机体其它部位发生的上皮性肿瘤在病变形态、生物学行为和预后方面均不同，病变形成时，遗传因素、DNA和RNA均可出现异常[7]。胶质瘤进展过程主要为侵袭性生长，表现为直接侵袭和血行转移，病因涉及多种分子生物学通路[8]。miRNAs表达失调是胶质瘤重要的分子进展因素[9]。miR-155-5p是在基因库中筛选出来的，主要与胶质瘤形成的分子通路有关，如cAMP/PKA和WNT通路等[10,11]。miR-155-5p对肿瘤调节过程与肿瘤进展有关，其可出现在肿瘤组织中，也可在血液中高表达，敏感程度较强。miR-155-5p具有癌基因样的作用，可使细胞的失控性增殖明显，并对下游的增殖因子和凋亡因子有明确的调控作用。曾庆等[12]通过观察miR-155-5p在宫颈癌中的表达，发现其表达上调，与肿瘤的生物学行为密切相关，同时可以调控肿瘤细胞的增殖过程。同样，有学者在肾癌和乳腺癌中发现了miR-155-5p的异常表达对肿瘤的促进作用，并认为其可能与肿瘤的预后有关[13-15]。

本研究应用胶质瘤术后的组织标本进行实验研究，结果显示胶质瘤中miR-155-5p的表达范围为0.98～1.99，平均1.46±0.42，具有一定的表达量，即miR-155-5p高表达是肿瘤形成的重要分子事件。miR-155-5p在不同肿瘤最大径、不同WHO分级分组的表达中差异有统计学意义，提示miR-155-5p高表达参与肿瘤生长和进展过程。miR-155-5p参与肿瘤生长是通过对肿瘤细胞的增殖和抑制凋亡实现的，其对血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶等具有调节作用，促进肿瘤的生长和局部侵袭[16]。miR-155-5p还能对S100B和NF等进行调控，但其具体机制有待更多基础实验证实。本研究结果显示，miR-155-5p的表达与患者术后的生存时间有关，提示miR-155-5p对判断肿瘤的预后有重要价值。miR-155-5p下游的主要调控因子为凋亡因子，可能与P27的调节通路有关[17]。本研究发现的miR-155-5p与Caspase-3、Bcl-2的关系也证实了miR-155-5p对凋亡的调节作用。凋亡途径中，Caspase-3是中心调节通路，可以激活BAX等途径，这也是miR-155-5p作用的主要途径之一[18,19]。miR-155-5p还能调节P53诱导的核因子表达，促进细胞增殖。Fu等[20]通过在肝细胞癌中观察miR-155-5p的表达，发现miR-155-5p通过PI3K/Ak途径抑制PTEN的表达，使肿瘤细胞增生活跃、细胞生长迅速、肿瘤体积增大。miR-155-5p可以加速G0/G1期的转化，使G2/M期细胞数减少，细胞增殖加速。但是，miR-155-5p对凋亡的具体调控及通路需要体外细胞学实验证实。研究中发现miR-155-5p对预后判断有价值，提示其可能是预后因子，但尚需在后续研究中进行多中心、大样本的验证来进一步明确。miR-155-5p作为预后因子的作用在临床中可能具有重要价值，可以更客观用指标来进一步规范评价。

总之，miR-155-5p在胶质瘤中表达升高，参与病变的形成和进展，其异常表达对调节细胞凋亡有一定作用，提示miR-155-5p可能是胶质瘤的预后因子。