基于UPLC-Q-TOF-MSE与网络药理学研究黄地安消胶囊干预2型糖尿病的主要物质基础和作用机制

张魏，单莉，朱梦情，刘晓闯，高家荣

·论著·

基于UPLC-Q-TOF-MSE与网络药理学研究黄地安消胶囊干预2型糖尿病的主要物质基础和作用机制

张魏，单莉，朱梦情，刘晓闯，高家荣

230031 合肥，安徽中医药大学第一附属医院药学部（张魏、单莉、朱梦情、刘晓闯、高家荣）；230012 合肥，安徽中医药大学药学院（张魏），中药复方安徽省重点实验室（高家荣）

运用 UPLC-Q-TOF-MSE结合网络药理学方法探索黄地安消胶囊治疗 2 型糖尿病（T2DM）的主要物质基础和作用机制。采用 UPLC-Q-TOF-MSE对 2 型糖尿病模型大鼠灌胃黄地安消胶囊后的血清样品进行检测，确定药物的入血成分，并通过 Swiss Target Prediction 数据库检索作用靶点，在 GeneCards 数据库和 DrugBank 数据库中检索 T2DM 相关作用靶点。所得成分疾病交集靶点进行 GO 功能和 KEGG 通路富集分析并进行可视化分析。黄地安消胶囊 28 个入血原型成分作用于 495 个靶点，与782 个 T2DM 相关靶点交集获得黄地安消胶囊治疗T2DM 的潜在作用靶点基因 141 个；PPI 进一步筛选出关键靶点 VEGFA、AKT1、SRC、EGFR 等。GO 富集分析中生物学过程条目 5050 个，细胞组分条目 431 个，分子功能条目 802 个；KEGG 富集分析获得与关键靶点相关通路 19 条。RT-qPCR 和 Western blot 实验结果表明，黄地安消胶囊含药血清可调控 HUVECs 中 VEGFA、AKT1、SRC、EGFR 的表达。黄地安消胶囊 28 个入血成分中木兰花碱、高良姜素、槲皮素等可能通过作用于 VEGFA、AKT1、SRC、EGFR 调控 AGE-RAGE 糖尿病并发症和 AMPK 等信号通路，从而发挥治疗作用。

黄地安消胶囊； 2 型糖尿病； UPLC-Q-TOF-MSE； 网络药理学； 实验验证

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一种由于胰岛 β 细胞分泌胰岛素减少和胰岛素抵抗导致胰岛素缺乏而引起的伴有多种并发症的代谢紊乱性疾病[1-2]。据国际糖尿病联合会估计，2019 年全球糖尿病的总患病人数约 4.63 亿，其中 T2DM 患者约占糖尿病患者总人数的九成[3]。中医药多成分、多途径、多靶点的治疗特点在 T2DM 及其并发症的治疗方面具有安全有效、副作用少的独特优势。

黄地安消胶囊临床应用多年，疗效确切。课题组前期研究黄地安消胶囊可通过降低糖尿病认知功能障碍（DCD）大鼠的血糖，改善 DCD 大鼠海马神经细胞的损伤和 Aβ 沉积[4]；在二甲双胍基础上配合黄地安消胶囊治疗后，明显改善患者胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、空腹血糖（FBG）水平，改善胰岛素抵抗[5]；此外，动物实验表明，黄地安消胶囊单独用药时，降低 FBG、随机血糖（RBG）、胰岛素受体底物-1（IRS-1）水平，GK 大鼠胰岛功能得到明显改善，从而治疗 T2DM[6-7]，但其药效物质基础和可能的作用机制并不明确。因此本研究采用 UPLC-Q-TOF-MSE技术对口服给药各模型大鼠的入血成分进行分析鉴定，结合网络药理学预测各成分对应的疾病靶点，通过构建成分-疾病靶点-通路网络分析黄地安消胶囊治疗T2DM 的药效物质基础和作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器 PTC-200 型 PCR 仪购自美国国Bio-Rad 公司；LX300 型低速迷你离心机购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；S-1-150S 台式高速冷冻离心机购自郑州宏华仪器有限公司；微量移液器购自德国 Eppendorf 公司；StepOnePlus 荧光定量 PCR 仪购自美国 ABI 公司；MINI-P25 微孔板迷你离心机购自杭州奥盛仪器有限公司；OD1000+ 超微量分光光度计购自南京五义科技有限公司；JW-3021HR 高速冷冻离心机购自安徽嘉文仪器装备有限公司；DHG-9070 电热恒温鼓风干燥箱购自上海散发科学仪器有限公司；JJ-79-1 磁力加热搅拌器购自常州市人和仪器厂；JS-M6P 自动曝光仪购自上海培清科技有限公司。

1.1.2 实验试剂 Trizol 购自美国 ThermoFisher 公司；氯仿购自上海苏懿化学试剂有限公司；无水乙醇购自上海广诺化学科技有限公司；异丙醇购自天津市致远化学试剂有限公司；引物均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；RIPA 裂解液、PMSF 均购自合肥兰杰柯公司；SDS、Glycine、PAGE 胶促凝剂、Tris、吐温-20、甲叉双丙烯酰胺均购自北京索莱宝科技有限公司；ECL 超敏发光试剂盒购自美国 Thermo 公司。

1.1.3 实验动物 SPF 级雄性 GK 大鼠，体质量（310.8 ± 11.3）g，62 日龄，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。在室温 20 ～ 25 ℃，相对湿度 40% ～ 60%，12 h 光暗交替环境中饲养。

1.2 方法

1.2.1 黄地安消胶囊含药血清的制备 将 GK 大鼠饲养至 5 月龄，以血糖> 11.1 mmol/L 作为 T2DM 模型造模成功的标准[8-9]，随机分为对照组（n = 5）和给药组（n = 5）。给药组每次以 15 g/kg的剂量进行灌胃，连续灌胃 3 d，每天两次；对照组灌胃相应体积蒸馏水。末次给药 4 h 后胸主动脉采血，室温静置，10 000 r/min离心 5 min，取上清液，即得黄地安消胶囊含药血清（HDAXC）。

1.2.2 “成分-靶点”网络的构建和分析 课题组前期质谱鉴定出的 28 个黄地安消胶囊入血原型成分，在 chem 2014 软件中转换成简化分子线性输入规范（simplified molecular input line entry specification，SMILES）输入 Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）进行成分作用靶点的检索。在 GeneCards（http://www.genecards. org/）数据库和 DrugBank（https://go.drugbank. com/drugs）数据库输入关键词“Type 2 Diabetes Mellitus”检索T2DM 相关靶点。将入血成分的预测靶点与 T2DM 相关靶点取交集，所得交集靶点即为黄地安消胶囊作用于 T2DM 的预测靶点。导入 Cytoscape 3.7.2 软件，对“入血成分-作用靶点”网络进行拓扑分析，筛选黄地安消胶囊作用于T2DM 的关键化合物。

1.2.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及关键靶点筛选 将得到的药物成分-疾病共同靶点上传至 STRING（https://string-db.org/）数据库，构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络模型，下载 PPI 网络数据导入 Cytoscape 3.7.2 软件对 PPI 网络进行拓扑分析，选取度值（degree）、介数（betweenness centrality，BC）和中心性（closeness centrality，CC）排名前十的靶点为关键靶点。

1.2.4 GO 功能富集分析和 KEGG 通路注释 将黄地安消胶囊入血原型成分治疗 T2DM相关的 141 个靶点导入 Metascape（http://metascape. org），用于基因本体富集（GO）和京都基因和基因组路径分析（KEGG）。以基因组中的所有基因作为富集背景，对所有项目进行筛选（< 0.01）[10]，通过 Cytoscape 3.7.2 软件进行可视化分析。

1.2.5 “成分-靶点-通路”网络构建 根据 KEGG 通路富集结果结合文献检索，筛选出与 T2DM 相关的信号通路，找出通路中的黄地安消胶囊治疗 T2DM 的相关靶点，结合黄地安消胶囊相关信息，构建黄地安消胶囊“组方药材-原型成分-靶点-通路”网络。

1.2.6 细胞培养 将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）接种在六孔培养板上，加入 25 mmol/L葡萄糖的溶液。正常组加入 5 mmol/L 葡萄糖和20 mmol/L 甘露醇，模型组加入 25 mmol/L 葡萄糖和 5 ng/ml TNF-α 后，孵育 48 h。另取模型组孵育 24 h 后给药，加入 20% 的含药血清，培养24 h[11-13]。收集细胞进行后续实验。

1.2.7 RT-qPCR 分析 使用 Trizol 试剂从 HUVECs 提取总 RNA，RT-qPCR检测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、血管内皮生长因子 A（VEGFA）、酪氨酸激酶（SRC）、表皮生长因子受体（EGFR）mRNA 水平。采用 2−ΔΔCT对各目的基因的相对表达量进行量化和归一化。

1.2.8 Western blot 分析 每组各取相同质量的 HUVEC 细胞样本，用 RIPA 裂解缓冲液裂解 HUVECs 总蛋白，在12 000 r/min 下离心 10 min，获得上清液，用 ECL 发光试剂盒检测蛋白浓度。标准方法检测 AKT1、VEGFA、SRC、EGFR 蛋白表达。各条带灰度值利用 Image J 图像分析软件进行分析，以 β-actin 进行校正。

1.3 统计学处理

采用 SPSS20.0 软件进行数据分析和处理，以随机区组设计的单因素方差分析（ANOVA）分析多组间差异，当< 0.05 时，其结果具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄地安消胶囊血中移行成分分析

课题组前期应用 UPLC-Q-TOF-MSE技术从黄地安消胶囊中得到 100 个化学成分[14]。此次在含药血清样品中检测到 53 个成分，对比分析后发现 28 个原型成分，主要为黄酮类、生物碱类及皂苷类（表 1）。

表 1 黄地安消胶囊 28 个入血原型成分UPLC-Q-TOF-MSE分析

续表 1

序号No.保留时间Rt (min)鉴别化合物Identified compounds正离子模式Positive ion (m/z) 负离子模式Negative ion (m/z)分子式Formula实际分子质量Mv (Da)碎片离子MS/MS (m/z)来源Source 分子质量Molecularmass误差ppm 分子质量Molecularmass误差ppm 1912.66大豆异黄酮Daidzein*255.0648-1.5 253.0495-4.6C15H10O4254.0567255, 237, 137, 119,253, 135, 117GG5 2012.88黄藤素Palmatine*352.15654.5 --C21H22NO4+352.1565352, 336, 308, 292,264HL7 2112.953'-甲氧基大豆黄素3'-Methoxydaidzein285.07611.3 283.0612-0.1C16H12O5284.0699285, 271, 255, 137,283, 268, 253GG8 2213.02小檗碱Berberine*336.12668.9 --C20H18NO4+336.1266336, 320, 306, 292,278HL8 2313.25槲皮素Quercetin*-- 301.03663.9C15H10O7302.0438301,151SQ1 2414.14高良姜素Galangin271.0597-1.5 269.04510.3C15H10O5270.0524271, 163, 153, 119,269, 161PPY1 2514.27人参皂苷Rb1Ginsenoside Rb1*1109.61120.8 1153.5996-1.3C54H92O231108.60141109, 947, 785, 623,1153, 1107, 945,783, 621, 553, 459SQ4 2614.27人参皂苷Rk1Ginsenoside Rk1767.4934-0.8 --C42H70O12766.4861767, 605, 443, 425,407, 343, 325SQ5 2716.15三七皂苷KNotoginsenoside K-- 991.54890.6C48H82O18946.5501991, 783, 621, 603,537SQ6 2816.15羽扇烯酮Lupenone425.3766-2.8 --C30H48O424.3693425, 409+GG10

注：*：与对照品比对得到鉴定的成分；-：未检测到；SDH：生地黄；HL：黄连；GG：葛根；PPY：枇杷叶；MD：麦冬；SQ：三七。

Notes:*: Indicates the components confirmed by comparison with the reference standards; -: Indicates no detection; SDH: Rehmanniae radix; HL: Coptis rhizoma; GG: Pueraria lobate radix; PPY: Eriobotryae folium; MD: Ophiopogonis radix; SQ: Notoginseng radix et rhizoma.

2.2 “成分-靶点”网络的构建和分析

28 个原型成分在 Swiss Target Prediction 数据库中检索到 1422 个靶点，去除重复项后得到 495 个靶点。在 GeneCards 数据库和 DrugBack数据库中检索获得 T2DM 相关靶点782 个。将以上靶点通过作韦恩图取交集，得到 141 个交集靶点（图 1A）。将 28 个原型成分和 141 个靶点导入到 cytocsape3.7.2 软件中，构建了一个包含 181 个节点、527 条边的“成分-靶点”交互网络（图 1B）对网络关系进行拓扑分析，28 个成分按度值、平均中心介数和平均中心度数降序排列。其中排名前 3 的是厚朴花素、高良姜素和槲皮素。

2.3 蛋白互作网络构建与分析

将上述 141 个交集靶点上传至STRING 数据库，用于 PPI 网络分析（图 1C）。该网络包括 141 个节点和 1533 条相互作用关系。通过 Degree、BC、CC 为筛选条件，排名前 10 位的靶点排列如图 1D，相关信息见表 2。

2.4 GO 富集分析和 KEGG 通路富集分析

在 Metascape 数据库中输入 141 个交集基因，其中 5050 个为富集生物过程（BPs），802 个为富含分子功能（MFs），431 个为富含细胞成分（CCs）。前 20 个条目如图 2A，涉及多种生物学过程，例如信号转导、免疫系统、基因表达等生物学过程。为了进一步探索获得的与 T2DM 相关的目标，我们展示了前 10 个靶点和前 20 个 GO 术语之间的关系（图 2B）。例如，TNF、AKT1、SRC 和 EGFR 参与了细胞对氮化合物的反应（GO：1901699），VEGFA、AKT1、SRC 和 MAPK3 参与了蛋白质磷酸化的正调节（GO：0001934）。KEGG 结果显示关键基因主要富集在糖尿病并发症中的 AGE-RAGE 信号通路和 AMPK 信号通路（图 2C）。如图 2D 所示，AKT1 参与 AMPK 信号通路（HSA04152），TNF、VEGFA、AKT1 和 EGFR 参与了 AGE-RAGE 合并糖尿病并发症的信号通路（HSA04933）。

图 1 基于网络药理学筛选药物疾病相关靶点（A：药物-疾病靶点交集；B：“原型成分-靶点”相互作用网络；C：黄地安消胶囊和T2DM 之间的交集靶点PPI 网络；D：黄地安消胶囊治疗T2DM 的前10 个核心靶点）

Figure 1 Screening of drug disease-related targets based on network pharmacology (A: Intersection of predicted targets of HDAXC and T2DM; B: “Prototype component-target” interaction network; C: Common target PPI network between HDAXC and T2DM; D: The top of 10 core target of HDAXC treatment of T2DM in PPI network)

表 2 黄地安消胶囊治疗 T2DM 核心靶点的信息

2.5 “成分-靶点-通路”网络构建结果

黄地安消胶囊 6 味药材、28 个入血原型成分和与排名前 10 的交集靶点构建黄地安消胶囊“组方药材-原型成分-靶点-通路”网络（图 3），可见，黄地安消胶囊治疗 T2DM 的过程涉及多个活性成分、靶点和通路。

2.6 AKT1、VEGFA、SRC、EGFR在 HUVECs 中的表达

在 TNF-α 联合高糖诱导的 HUVECs 中，检测了 AKT1、VEGFA、SRC、EGFR 的表达。如图 4和图 5 所示，与对照组相比，模型组 AKT1、VEGFA、SRC 和 EGFR 的表达水平显著升高，而 HDAXC 组的 AKT1、VEGFA、SRC 和 EGFR 的表达水平明显低于模型组。

3 讨论

本研究基于网络药理学方法，借助 UPLC-Q-TOF-MSE技术及相应的数据软件，对28个黄地安消胶囊入血原型成分建立“成分-疾病靶点”网络，发现入血成分中的木兰花碱、高良姜素、槲皮素等化合物靶向T2DM 关键基因。PPI 网络分析 VEGFA、AKT1、SRC、EGFR 可能为黄地安消胶囊治疗 T2DM 的关键基因。

RT-qPCR 和Western blot实验验证在 TNF-α 和高糖诱导的 HUVECs 中AKT1、VEGFA、SRC、EGFR mRNA 和蛋白表达水平升高，黄地安消胶囊可干预 AKT1、VEGFA、SRC、EGFR 的表达。Viigimaa 等[15]研究发现，PI3K 和 Akt 活性下降，导致 GLUT-4 表达和活性下降，使胰岛素结合反应和活性受损。另外，PI3K 和 Akt 活性的降低可使内皮 NO合酶（eNOS）失活，进而导致 NO 数量减少并进一步导致内皮功能障碍，从而参与动脉粥样硬化疾病的发展[16]。Mayurkumar 和Shrihari[17]通过建立糖尿病小鼠模型发现木兰花碱可改善晶状体醛糖还原酶引起的糖尿病及并发症。木兰花碱促进 Akt 磷酸化，降低 T2DM 大鼠的空腹血糖水平[18]。高良姜素通过抑制 PI3K/Akt 和 Wnt/β-catenin 信号通路，改善肝纤维化[19]。VEGFA 是糖尿病血管生成的关键物质，诱导血管生成和增加血管通透性[20]。Zu 等[21]发现槲皮素通过 AKT1、VEGFA、EGFR 等基因调控 AGE-RAGE 糖尿病并发症信号通路、癌症信号通路，干预 T2DM 的发展。槲皮素可通过抑制人脐静脉血管内皮细胞的迁移侵袭，降低 VEGFA 的表达，改善食管癌细胞迁移与血管生成[22]。另有研究通过蛋白免疫印迹实验表明当槲皮素逆转癌前病变时，EGFR 的表达量显著减少[23]。SRC在巨噬细胞天然免疫中发挥多种作用，巨噬细胞参与糖尿病等多种免疫反应和炎症性疾病[24]。同时，槲皮素可通过抗炎作用改善 T2DM 小鼠的肝脏损伤[25]。

KEGG 通路富集结果表明，黄地安消胶囊可能通过调节 AGE-RAGE 合并糖尿病并发症信号通路（HSA04933）、AMPK 信号通路（HSA04152）发挥治疗作用。AGE/RAGE 信号通路通过激活 NOx-1 和降低 SOD-1 的表达来增加氧化应激，从而促进糖尿病介导的血管钙化[26]。六味地黄丸中调控 AGE-RAGE 糖尿病并发症信号通路治疗 T2DM 及其并发症（动脉粥样硬化和肾病），参与抗炎、抗氧化应激和减轻 β 细胞损伤[27]。在高糖处理的 HUVECs 中，甘氨酸可能通过抑制 AGE/RAGE 信号通路和随后的氧化应激，从而预防糖尿病大血管并发症[28]。黄芪-葛根药对调控 AMPK 信号通路影响胰岛素抵抗、糖原合成、糖异生、胰岛 β 细胞、炎症反应等过程对糖尿病发挥治疗作用[29]。健脾消渴方可能通过 AMPK/mTOR 信号通路改善胰岛功能，增加胰岛素分泌，改善糖尿病的发展[30]。

A

B

C

D

Figure 2 GO and KEGG enrichment analysis (A: The top 20 GO enrichment analysis of 141 targets; B: The top 10 targets analysis of GO enrichment; C: The top 20 KEGG enrichment analysis of 141 targets; D: The top 10 targets analysis of KEGG enrichment)

图 3 黄地安消胶囊“成分-靶点-通路”网络（蓝色椭圆节点代表主要药物成分，红色椭圆节点代表核心靶点，绿色长方形节点代表涉及的信号通路）

Figure 3 HDAXC-prescription composition-prototype “components-targets-pathways” (Blue oval nodes represent major drug components, red oval nodes represent core targets and green rectangular nodes represent signalling pathways involved)

图 4 AKT1（A）、VEGFA（B）、SRC（C）、EGFR（D）mRNA 的表达（#P < 0.01 为与对照组相比较，*P < 0.01 为与模型组相比较）

Figure 4 Change in AKT1 (A), VEGFA (B), SRC (C) and EGFR (D) mRNA expression was observed by qPCR (#< 0.01 for comparison with control group,*< 0.01 for comparison with model group)

图 5 AKT1（A）、VEGFA（B）、SRC（C）、EGFR（D）蛋白表达以及蛋白免疫印迹图（E）（#P < 0.01 为与对照组相比较，*P < 0.01 为与模型组相比较）

Figure 5 Change in AKT1 (A), VEGFA (B), SRC (C) and EGFR (D) protein expression was observed by Western blot (E) (#< 0.01 for comparison with control group,*< 0.01 for comparison with model group)

本研究预测了黄地安消胶囊中的 28 个活性成分、10 个潜在靶点和 19 个相关信号通路并对 4 个关键基因进行 RT-qPCR 和Western blot实验验证。其中，木兰花碱、高良姜素、槲皮素等可能通过 AGE/RAGE 合并糖尿病并发症信号通路、AMPK 信号通路等作用于 AKT1、VEGFA、SRC、EGFR 等靶点，参与T2DM 及其并发症的发生发展。阐明了黄地安消胶囊治疗T2DM 的药效物质基础和可能的作用机制，为后续药理研究拓宽了思路。

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To study the mechanism and main material basis of Huangdi Anxiao capsules in the treatment of T2DM using UPLC-Q-TOF-MSEcombined with network pharmacology

ZHANG Wei, SHAN Li, ZHU Meng-qing, LIU Xiao-chuang, GAO Jia-rong

Author Affiliations:Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031, China (ZHANG Wei, SHAN Li, ZHU Meng-qing, LIU Xiao-chuang, GAO Jia-rong); College of Pharmacy (ZHANG Wei), Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula (GAO Jia-rong), Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China

To explore the main material basis and mechanism of action of Huangdi Anxiao capsules (HDAXC) in the treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM) by using serum medicinal chemistry combined with network pharmacology.UPLC-Q-TOF-MSEwas used to detect the blood components of the drug from serum samples of T2DM model rats after gavage of HDAXC, and T2DM-related targets was searched through the Swiss Target Prediction database, the GeneCards database and DrugBack database. The intersection targets of drug and disease were subjected to the GO function and KEGG pathway enrichment in the Metascape database and visualized.A total of 53 blood components were detected in the serum samples, including 28 prototype components. The28 blood-entry prototype components of HDAXC acted on 495 targets, and 141 T2DM-related targets were retrieved. The intersection of the three was used to obtain the potential target genes of HDAXC in the treatment of T2DM. According to PPI network, VEGFA, AKT1, SRC and EGFR might be the key target genes of HDAXC in the treatment of T2DM. In GO function analysis, 5050 genes were classified into biological processes (BPs), 431 into cell components (CCs) and 802 into molecular functions (MFs). 19 pathways related to key targets were obtained by KEGG enrichment analysis. Experimental verification showed that the key blood ingredient of HDAXC effectively inhibited the protein and gene expression of the key targets.Among the 28 blood components of HDAXC, magnoflorine, galangin, quercetin and et al. may act on VEGFA, AKT1, SRC and EGFR to regulate AGE-RAGE diabetes complications and AMPK signaling pathways, thereby playing therapeutic effects.

Huangdi Anxiao capsule; type 2 diabetes mellitus; UPLC-Q-TOF-MSE; network pharmacology; experimental verification

LIU Xiao-chuang, Email: zyyxcliu@ahtcm.edu.cn; GAO Jia-rong, Email: zyfygjr2006@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.005

安徽省重点研究与开发计划（2022e07020024）；安徽中医药大学第一附属医院临床科学研究项目（2020yfyzc05）

刘晓闯，Email：zyyxcliu@ahtcm.edu.cn；高家荣，Email：zyfygjr2006@163.com

2022-02-25